【技术实现步骤摘要】
一种外泌体包裹AAV载体、AAV-靶基因载体及其制备方法和应用
本专利技术属于基因药物载体
,具体涉及一种外泌体包裹AAV载体、AAV-靶基因载体及其制备方法和应用。
技术介绍
腺相关病毒(Adeno-associatedvirus,AAV)是属微小病毒科家族的无包膜病毒。AAV对人无致病性,只有在辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒存在下才能复制。AAV基因组是约4.7kb的单链线状DNA分子,在每个末端都有发夹结构的反向末端重复序列(ITRs),ITRs的功能在于基因组复制起始位点及包装病毒粒子。AAV病毒中能够插入小于2.5kb大小的DNA片段。AAV载体在体内基因转染效率高,整体安全性好,已成为首选的基因药物载体。AAV虽然是首选药物载体,由于生物本身存在中和抗体、血脑屏障和血眼屏障等原因,临床试验治疗效果远不及动物实验效果。因此考虑AAV的转染效率不佳造成差异。外泌体(exosomes)由含有跨膜蛋白、胞质蛋白和各种核酸的脂质双层组成。其粒径在40~200nm之间,主要是细胞膜内陷形成的包含溶酶体微粒的多囊泡体(MVBs),经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。是一种很有前途的新型药物和基因传递载体。与传统AAV载体比较,外泌体作为基因药物载体具有以下优点:1.外泌体具有粒径小、生物相容性高、免疫性低等优点;2.外泌体可以递送基因药物、蛋白质和小分子药物等;3.外泌体可以穿过血脑屏障和血眼等屏障,且在体内对中和抗体表现出显著的抗性;4.外泌体包裹AAV载体 ...
【技术保护点】
1.一种外泌体包裹AAV载体的制备方法,其特征在于,步骤如下:/n(1)、将HEK-293T细胞用DMEM完全培养基培养,待细胞生长至融合度达60%-80%时用于转染,转染前1-4 h用DMEM基础培养基置换旧的培养基;/n(2)、将pAAV-ZsGreen质粒、pRC2-miR342质粒和pHelper质粒共转染至步骤(1)所得HEK-293T细胞培养液中,37 ℃共转染 12-16 h之后,加入无外泌体胎牛血清,继续培养48-72 h,收集上清,离心分离,获得外泌体包裹AAV载体。/n
【技术特征摘要】
1.一种外泌体包裹AAV载体的制备方法,其特征在于,步骤如下:
(1)、将HEK-293T细胞用DMEM完全培养基培养,待细胞生长至融合度达60%-80%时用于转染,转染前1-4h用DMEM基础培养基置换旧的培养基;
(2)、将pAAV-ZsGreen质粒、pRC2-miR342质粒和pHelper质粒共转染至步骤(1)所得HEK-293T细胞培养液中,37℃共转染12-16h之后,加入无外泌体胎牛血清,继续培养48-72h,收集上清,离心分离,获得外泌体包裹AAV载体。
2.如权利要求1所述的外泌体包裹AAV载体的制备方法,其特征在于,步骤(2)的具体过程为:将10-15μgpAAV-ZsGreen质粒、10-15μgpRC2-miR342质粒和20-25μgpHelper质粒加入50-100μLCaCl2溶液和水中,三质粒均以其溶液形式添加且溶液浓度均为1-2μg/μL,CaCl2溶液的浓度为2-3M,水的用量为三质粒溶液总体积的10倍,吹打混匀;将混匀的三质粒溶液涡旋状态下滴加到500-1000μL2×HeBS溶液中,室温静置20-30min后,再滴加到8-10mL步骤(1)所得HEK-293T细胞培养液中,37℃共转染12-16h之后,加入160-200μL无外泌体胎牛血清继续培养48-72h,收集细胞培养上清,离心分离,获得外泌体包裹AAV载体。
3.如权利要求1所述的外泌体包裹AAV载体的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述离心分离的具体过程为:首先,3-5℃300-600g离心10-15min,离心结束收集上清液,然后将收集的上清液3-5℃2000-2500g离心10-15min,离心结束收集上清液;进一步将收集的上清液3-5℃100000g离心1-1.5h,离心结束去除上清,收集底部沉淀,加入PBS重悬沉淀,再次3-5℃100000g离心1-1.5h,离心结束去除上清,收集底部沉淀,所得沉淀即为外泌体包裹AAV载体。
4.一种利用如权利要求1~3任一所述制备方法制备的外泌体包裹AAV载体。
5.一种外泌体包裹AAV-靶基因载体的制备方法,其特征在于,步骤如下:
(1)、pAAV-ZsGreen质粒首先经过EcoRI酶切,获得线性pAAV-ZsGreen质粒;然后通过同源重组法将靶基因构建到线性pAAV-ZsGreen质粒中,通过无内毒素质粒大提试剂盒提取pAAV-靶基因-ZsGreen质粒;
(2)、将HEK-293T细胞用DMEM完全培养基培养,待细胞生长至融合度达60%-80%时用于转染,转染前1-4h用DMEM基础培养基置换旧的培养基;
(3)、将pAAV-...
【专利技术属性】
技术研发人员:雷博,王卫萍,刘婧阳,郝冰涛,
申请(专利权)人:河南省眼科研究所,
类型:发明
国别省市:河南;41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。