天然配体介导的多靶点识别可调控基因工程化免疫细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了天然配体介导的多靶点识别可调控基因工程化免疫细胞的制备方法。为了解决CAR‑T治疗的有效性和安全性问题，发明专利技术人将生长因子对靶点的识别部分和CAR‑免疫细胞和活化结构域分开构建，在肿瘤靶向治疗中，采用标签分子修饰生长因子作为调控蛋白，通过在免疫细胞上构建标签特异性CAR，制备新型的多靶点识别可调控基因工程化免疫细胞，从而实现对肿瘤相关抗原多靶点稳定识别的同时，提高其安全可控性，以克服串联抗体的CAR‑T细胞在治疗过程中危险性大的困难。

【技术实现步骤摘要】
天然配体介导的多靶点识别可调控基因工程化免疫细胞的制备方法
本专利技术涉及采用天然配体介导基因工程化免疫细胞，用于改进抗肿瘤免疫治疗的多靶点识别活性和安全可控性。
技术介绍
近年来，癌症免疫治疗备受关注，是癌症治疗领域的焦点。2011年12月，Nature及临床肿瘤最顶级杂志JournalofClinicalOncology分别发表相同题目《Cancerimmunotherapycomesofage》的评论文章，评价免疫疗法是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，该方法弥补了传统疗法的弊端，被认为是二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段。嵌合抗原受体-T(ChimericAntigenReceptor-T，CAR-T)细胞技术是通过基因修饰T细胞，特异识别肿瘤特异性或相关性抗原，对肿瘤细胞发挥毒性效应，从而发挥抗肿瘤作用的免疫治疗技术。CAR-T免疫治疗概念最早由Dotti(1)等提出，到目前临床试验治疗白血病上取得突破性进展已有接近30年时间，经不断的科学研究和临床转化，CAR-T技术已经历了4代革新(2)。但目前临床上应用的绝大部分仍然是第二代的CAR分子结构，常用的同刺激分子有CD28、CD137、OX40等。相比于经典的T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)-人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)复合体识别模式，CAR分子对肿瘤细胞的识别依赖于抗体的特异性，因此更加简单和明确，同时避免了HLA分子表达下调引起的肿瘤免疫逃逸的问题。CAR分为胞内信号肽区、跨膜区和胞外抗原结合区3部分：胞外结合抗原区结合抗原发挥特异性。CAR的跨膜区由信号分子组成，比如CD3、CD3ζ、CD4、CD28等。胞内信号肽区包括T细胞受体CD3ζ链或FcεRIγ上的酪氨酸等。CAR修饰T细胞是从患者外周血细胞中分选出T细胞，然后运用基因工程技术转染CAR至T细胞中形成嵌合抗原受体T细胞(3)。通过慢病毒转染CAR基因修饰T细胞，修饰后的T细胞携带具有特异识别肿瘤细胞的抗原，同时具有自我复制和杀伤肿瘤细胞的能力。因此，CAR-T特异识别肿瘤细胞，靶向杀伤肿瘤细胞，减小肿瘤微环境的影响。CAR-T不但不受MHC限制性的影响，而且识别抗原多元化，不存在TCR错配风险。CAR-T也能直接抑制瘤细胞的生长，CAR-T分泌细胞的因子如γ干扰素(IFN-γ)，从而诱导巨噬细胞分泌白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素12(IL-12)抑制肿瘤细胞的生长(4)。CAR-T细胞除有自身独特的杀伤作用外，还能激活机体免疫系统，发挥抗肿瘤作用。相比于CAR-T细胞疗法在血液肿瘤中的突飞猛进，CAR-T细胞在实体肿瘤的治疗中表现出的临床效果差强人意。相比于血液肿瘤，实体肿瘤组织成分复杂，缺乏理想的特异靶点。为达到理想的治疗效果，目前有多达22个不同的靶标(其数量甚至超过血液肿瘤的数量)正在被尝试用于实体肿瘤的CAR-T细胞治疗。这其中，开展比较多的有表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)、人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2)和间皮素(mesothelin，MSLN)等靶点。目前已经报道的研究中通常是使用单靶点，但传统的单靶点CAR-T具有很多缺点，如:易发生免疫逃避。CAR-T细胞治疗肿瘤面临的困难就是治疗靶点的问题。与血液肿瘤相比，为复杂的实体肿瘤选择一个合适的靶点更加困难，这主要有两方面的原因。首先，在血液肿瘤中，如ALL几乎所有的肿瘤细胞都表达CD19或CD20，因此以这两个抗原为靶点的CAR-T细胞治疗有望清除所有肿瘤细胞，从而带来血液肿瘤的治愈。与之相比，实体肿瘤组织内的细胞组成复杂，不同的肿瘤细胞往往会有不同的蛋白表达谱，单一靶点难以覆盖所有肿瘤细胞。理论和实践经验均显示，即使表达某抗原的肿瘤细胞可以被有效清除，仍会有大量抗原阴性的肿瘤细胞残留，这种不完全的表型覆盖是无法达到肿瘤治愈要求的。其次，实体肿瘤中难以找到一个肿瘤特异的抗原靶点，现有CAR-T细胞治疗实体肿瘤的实验中选择的大多是肿瘤中特异高表达的抗原，而这些抗原往往在某些正常组织中仍然会有低量的表达，例如HER2、EGFR等。这就大大增加了CAR-T细胞在治疗实体肿瘤中发生CAR-T细胞攻击正常组织的可能性，称之为靶向毒性。随着CAR-T细胞抗肿瘤功能的增强，脱靶带来副作用的危害性也会随之提高。针对这些问题，目前行之有效的解决方案是采取多靶点的策略，即多靶点CAR-T细胞联合。多靶点CAR-T细胞联合可寻求更高比例肿瘤细胞的覆盖，多靶点的覆盖可以提高CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的比例，更高比例肿瘤细胞的清除预期或许可以提高患者的生存获益。这种多靶点(双靶、甚至多靶)CAR-T细胞治疗的策略在B细胞白血病的治疗中也有应用，例如同时靶向CD19和CD20的CAR-T细胞治疗被认为可以有效防止CD19阴性白血病的复发(5)(6)。多靶点覆盖可以通过输注混合的CAR-T细胞实现。另外，也可以通过在CAR分子上整合两个(或多个)靶向不同抗原的单链抗体(singlechainantibody，scFv)区段来实现(7)，即串联抗体的方法，而双靶点CAR-免疫细胞在制备过程中通常因为串联表达的抗体在细胞表面的错配或者空间位阻造成CAR-免疫细胞靶向识别功能降低，甚至造成严重的脱靶毒性。采用细胞生长因子天然配体用于识别多个肿瘤相关抗原目前已经有过报道，不过将生长因子作为CAR-免疫细胞的直接识别位点，通常因为无法区别肿瘤组织和正常组织，从而造成严重的脱靶毒性。因此，选择合适的肿瘤相关抗原识别的生长因子天然配体，并且在此基础上构建肿瘤靶向识别和CAR-T细胞下游信号转导分离开的可调控CAR-T治疗策略成为方法的重要思想。B淋巴细胞刺激物(B-cellactivatingfactor，BLyS)是调节B细胞成熟，存活和功能的肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员，它们在多种自身免疫疾病中过表达。BLyS是典型的II型跨膜蛋白，N端在包内，缺少信号肽序列，C端在胞外。BLyS是由285个氨基酸组成的分子量为31.3kD的单练糖蛋白，其中N端1～46位氨基酸为胞内区，47～73位氨基酸为疏水的跨膜区，74～285位氨基酸为胞外区，133～285位氨基酸为其发挥功能的主要区域，BLyS可能有一个糖基化位点(N242)，无二硫键存在，人鼠同源性为93％。BLyS有很强的B细胞趋向性，作为一种淋巴细胞的共刺激因子，BLyS对活化的B细胞有强烈地促进增殖和分化的刺激作用。已经在许多B细胞恶性肿瘤中鉴定出BLyS及其受体的表达增加。BLyS的生物学效应由三种细胞表面受体介导，称为B细胞激活因子受体(B-cellactivatingfactorreceptor，BAFF-R)，跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用(transmembraneactivatorandCAMLinteractor，T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗肿瘤CAR-免疫细胞的组合物，包括CAR-免疫细胞和天然配体为基础构建的调控蛋白，其特征在于：/n所述天然配体为可以和肿瘤或其组织表面相关受体特异性结合的天然存在配体分子；/n所述CAR-免疫细胞的CAR结构域连接有识别分子，所述识别分子用于特异性识别标签分子；/n所述调控蛋白具有识别多种肿瘤或其组织相关抗原的天然配体分子和标签分子，所述标签分子可与所述CAR-免疫细胞的CAR胞外识别结构域的所述识别分子特异性结合。/n

【技术特征摘要】
20190122 CN 20191005925391.一种抗肿瘤CAR-免疫细胞的组合物，包括CAR-免疫细胞和天然配体为基础构建的调控蛋白，其特征在于：
所述天然配体为可以和肿瘤或其组织表面相关受体特异性结合的天然存在配体分子；
所述CAR-免疫细胞的CAR结构域连接有识别分子，所述识别分子用于特异性识别标签分子；
所述调控蛋白具有识别多种肿瘤或其组织相关抗原的天然配体分子和标签分子，所述标签分子可与所述CAR-免疫细胞的CAR胞外识别结构域的所述识别分子特异性结合。


2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述调控蛋白中识别肿瘤或其组织相关抗原的天然配体是BLyS、APRIL和VEGF中的至少一种。


3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述标签分子选自FITC，生物素，His标签，Flag标签，Myc标签，GCN4标签，HA标签，V5标签，壳聚糖结合蛋白(CBP)标签，麦芽糖结合蛋白(MBP)，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和DNAAptamer标签中的一种。


4.根据权利要求1～3任一项所述的组合物，其特征在于：
所述调控蛋白的天然配体分子和标签分子之间通...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹宇，李书宏，赵丽君，郭建，王莹莹，王志东，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44