一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术涉及一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法。本发明专利技术制备的融合蛋白疫苗，系采用经过密码子优化、含有3个氨基酸突变的产气荚膜梭菌ε毒素以及含有4个氨基酸突变和11个氨基酸缺失的腐败梭菌α毒素的融合蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。该疫苗还具有制备工艺简单，疫苗效力优良等优点，较我国目前商品化的羊快疫和羊肠毒血症灭活疫苗大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是我国现行产气荚膜梭菌和腐败梭菌病疫苗升级换代的理想候选疫苗；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

A Noxious Fusion Protein Vaccine of Clostridium perfringens and Clostridium putrefaciens and Its Production Method

【技术实现步骤摘要】
一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法
本专利技术涉及无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
产气荚膜梭菌和腐败梭菌是能够引起人和多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大。其中，产气荚膜梭菌是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊猝疽、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症的主要病原之一，腐败梭菌是羊快疫的主要病原。两种梭菌的致病因素均是菌体分泌的外毒素。根据产生4种主要致死性外毒素α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)的种类，可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E五个毒素型(Revitt-Mills,S；Rood,J；Adams,V.Clostridiumperfringensextracellulartoxinsandenzymes:20andcounting.Microbiol.Aust.2015,36,114-117.)，而腐败梭菌只有一种关键的致死性毒力因子，即α毒素(TwetenRK.ClostridiumperfringensbetatoxinandClostridiumsepticumalphatoxin:theirmechanismsandpossibleroleinpathogenesis[J].VetMicrobiol,2001,82(1):1-9.)。由于产气荚膜梭菌病和腐败梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病，往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法(陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社，2013:194-196.)。目前，针对以上两种病使用的商品化疫苗主要是灭活疫苗，该类疫苗在预防动物产气荚膜梭菌和腐败梭菌所致疾病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的产气荚膜梭菌和腐败梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。目前，市场用量较大的商品化的梭菌灭活苗主要是羊快疫、猝疽、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活苗以及羊梭菌病多联干粉苗。其中，羊快疫主要是由腐败梭菌分泌的α毒素(CSA)引起(TwetenRK.ClostridiumperfringensbetatoxinandClostridiumsepticumalphatoxin:theirmechanismsandpossibleroleinpathogenesis[J].VetMicrobiol,2001,82(1):1-9.)，肠毒血症主要与D型产气荚膜梭菌分泌的ε毒素(ETX)有关。CSA由440或443个氨基酸构成，主要分为D1、D2和D3三个结构域。其中，D1结构域是一个复杂的多功能结构域，在受体结合，寡聚化和孔形成过程中均发挥作用，该结构域内45个关键性氨基酸位点突变的突变体中，有17种突变体丧失细胞溶血活性，而细胞结合活性则各不相同。D2结构域主要参与孔形成过程，而D3结构域主要参与毒素分子的寡聚化。已有的研究发现，删除位于D2区的双亲性β发夹跨膜区内的11个氨基酸(第212位～第222位)不会明显改变CSA的正常折叠，但使CSA完全丧失细胞毒性和其在腐败梭菌病中的作用，而该重组毒素的抗原性未得到验证(KennedyCL,LyrasD,CordnerLM,etal.Pore-formingactivityofalpha-toxinisessentialforclostridiumsepticum-mediatedmyonecrosis[J].Infection&Immunity,2009,77(3):943-951.)。ETX主要是由B型和D型产气荚膜梭菌产生，全长296个氨基酸，以前毒素的形式分泌于菌体外。前毒素被宿主的胰蛋白酶和糜蛋白酶或梭菌自身的蛋白酶作用后，去除N端11-13个以及C端22-29个氨基酸，从而活化为成熟毒素。该毒素属于β穿孔素家族成员，是产气荚膜梭菌毒素中毒力最强的毒素，其毒力仅次于肉毒杆菌素和破伤风神经毒素(LiJH,AdamsV,BannamTL,MiyamotoK,GarciaJP,UzalFA,RoodJL,McClaneaBA.Toxinplasmidsofclostridiumperfringens,MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,2013,77(2):208-233.)。因此，实现毒素的减毒甚至无毒以及构建相关减毒或无毒体，对于开发毒素基因工程亚单位疫苗以及其作为抗原组分的多价亚单位疫苗的研究和应用就显得尤为重要。目前虽然已有产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体的报道，如中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于力等(“产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体及其应用”，申请号：201410707351.6)将野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素的第71位酪氨酸突变为非芳香族氨基酸，获得了对于细胞或动物体减毒的ε毒素突变体，由于该申请仅突变1个氨基酸，易发生回复突变而重新成为毒力极强的毒素，从而给未来实际的疫苗大规模生产带来严重的生物安全风险。中国动物疫病预防控制中心宋晓晖等(“抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε蛋白及其制备方法与应用”，申请号：201610301989.9)设计了3种重组ε毒素蛋白，但均缺失了野生型ε毒素蛋白的前50个氨基酸残基，这种采用蛋白片段作为免疫原的策略，很可能会导致抗原蛋白的抗原性不完整，从而影响其免疫原性。
技术实现思路
本专利技术目的在于制备出产气荚膜梭菌ETX突变体和腐败梭菌CSA突变体的融合蛋白(rETXm3CSAM4△11)，一方面最大限度地保持相应毒素的免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，用于预防羊快疫、肠毒血症。本专利技术技术方案1.一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述疫苗含有的融合蛋白系由重组表达rETXm3CSAM4△11的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)，被命名为大肠埃希氏菌BL/EC株制备的，该菌株已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.17165；所述融合蛋白的编码基因，是根据产气荚膜梭菌ETX和腐败梭菌CSA的天然基因序列，经密码子优化后，将含有多个氨基酸突变的ETX编码基因以及含有多个氨基酸突变和氨基酸缺失的CSA编码基因进行串联，并在其C端添加氨基酸标签编码基因构建而成，进而通过宿主细胞表达获得了对于动物体无毒的融合蛋白。2.本专利技术所述产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述融合蛋白rETXm3CSAM4△11，与野生型产气荚膜梭菌成熟ETX相比，含有多个氨基酸的突变，优选的为3个氨基酸突变，分别为第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于该疫苗含大肠埃希氏菌表达的产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)突变体和腐败梭菌α毒素(CSA)突变体的融合蛋白；制苗用菌种为表达融合蛋白的大肠埃希氏菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL/EC株，该菌株已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17165；该疫苗用于同时预防由产气荚膜梭菌和腐败梭菌感染和引起的羊快疫和肠毒血症。

【技术特征摘要】
1.一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于该疫苗含大肠埃希氏菌表达的产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)突变体和腐败梭菌α毒素(CSA)突变体的融合蛋白；制苗用菌种为表达融合蛋白的大肠埃希氏菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL/EC株，该菌株已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17165；该疫苗用于同时预防由产气荚膜梭菌和腐败梭菌感染和引起的羊快疫和肠毒血症。2.如权利要求1所述一种无毒产气荚膜梭菌和腐败梭菌融合蛋白疫苗，其特征在于所述融合蛋白，与野生型成熟ETX相比，含有多个氨基酸突变，优选的为以下3个氨基酸突变：第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸；与野生型成熟CSA相比，含有多个氨基酸突变，优选的为以下4个氨基酸突变：第54位半胱氨酸突变为亮氨酸，第264位天冬酰胺突变为丙氨酸，第269位组氨酸突变为丙氨酸，第310位色氨酸突变为丙氨酸；同时，缺失多个氨基酸，优选的为缺失11...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜吉革，陈小云，刘莹，朱真，薛麒，印春生，李启红，康凯，姚文生，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11