牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种牛A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens type A灭活类毒素疫苗及其制备方法。本发明专利技术使用产毒水平较高、免疫原性良好、培养特性稳定的牛源A型产气荚膜梭菌菌株制备牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗。通过优化培养基配方及培养条件，提高了培养稳定性和基础抗原效价，获得了高MLD水平的α毒素液；通过安全、便捷、高效的α毒素浓缩方式，提升了α毒素回收率，降低了培养成本；使用高含量类毒素抗原制苗而得到一种安全性好、高效力、低免疫剂量的牛A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。

Bovine Clostridium perfringens type A inactivated toxoid vaccine and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗及其制备方法
本专利技术属于生物医药领域中的疫苗及其制备方法，特别是涉及一种牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗及其制备方法。
技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)，又称魏氏梭菌，存在于很多健康动物的肠道中，当饲养和环境条件改变时，可引起畜禽的产气荚膜梭菌病，一旦发病，会导致畜禽迅速死亡，病程极短，往往在未得到有效治疗前便死亡。自产气荚膜梭菌在我国发现以来，在全国各个地区的畜禽中出现了一种病程短、发病急、死亡快、死亡率高的疾病(产气荚膜梭菌病)，并且有时候该病的症状不明显，往往在发病治疗之前，畜禽便开始死亡，给我国的畜牧养殖业造成了不可估量的经济损失。今年以来，对数百份来自规模化奶牛场的猝死牛病料病原分离鉴定，发现95％以上的猝死动物死于A型产气荚膜梭菌。A型产气荚膜梭菌可致人类食源性感染，目前对人类和畜牧业造成的巨大损失是不言而喻的。针对该病的特点，国内外相关部门已给予了足够重视，针对该病已研发出疫苗预防其爆发。A型产气荚膜梭菌分泌的α毒素最多，根据测序结果得知，α毒素是由398个氨基酸组成的单链多肽，其中28个氨基酸为信号肽，其余370个氨基酸为成熟肽，分子量约为43KDa。目前，国内外关于A型产气荚膜梭菌病的研究大多集中于该病的诊断，但由于各种条件和因素的制约，对该病的诊断和控制并没有达到理想的效果。针对该病的预防，注射疫苗是主要手段，集中于菌体疫苗、类毒素疫苗、α毒素亚单位疫苗，但是可供市场使用的少量疫苗仍停留在菌体疫苗的水平上，因菌体疫苗存在安全性风险及注射剂量大的缺陷，且目前疫苗的数量及免疫效果远不能满足市场需求，因此亟需开发一种安全性好、高效力、低免疫剂量的纯类毒素疫苗来防控畜禽猝死症。基于牛A型产气荚膜梭菌病发病急、死亡率高、发病后用药治疗效果不明显，因此为了有效预防和控制牛A型产气荚膜梭菌病的发生，研制高效、安全的类毒素灭活疫苗并采取有效措施评价其效力刻不容缓。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供一种安全性好、高效力、低免疫剂量的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗。本专利技术所提供的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，是以免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeA菌株作为制苗用菌种，用专用培养基在适宜条件下培养，获得α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液，菌液经灭活后离心、过滤除菌体，使用膜孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩α毒素，制苗，得到牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeA灭活类毒素疫苗。所述免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeA菌株包括CNM0702株、CNM0708株、CNM0715株、CNM0730株和CNM0732株，其分离于内蒙古呼和浩特土左旗牛场，具有α毒素致死性。这些菌株属于本
技术实现思路
。其中：牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeACNM0708菌株已于2017年11月14日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14880。保藏编号为CGMCCNo.14880的菌株牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeACNM0708属于本
技术实现思路
。所述专用培养基配方为：将上述成分用水溶解后，调pH值至8.0-8.5，灭菌，使用时加入培养基体积0.5-1％的葡萄糖。该专用培养基也属于本专利技术。所述适宜培养条件为：菌种含量1-2％，36-37℃静置培养5-7小时。针对A型产气荚膜梭菌培养菌液所述灭活的方法为：使用0.4％-0.8％(V/V)甲醛溶液灭活，37℃灭活2-3天，每日振摇2-3次。灭活的A型产气荚膜梭菌培养菌液进行离心、过滤除菌体的方法为：先4℃、6000-8000rpm离心20-30min(优选4℃、8000rpm离心30min)，再使用0.45μm级过滤器对离心上清液进行过滤除去菌体，留滤过液。用膜孔径3-5KD的中空纤维柱膜浓缩α毒素，可将α毒素浓缩10-20倍。以浓缩10倍为例，浓缩方法为：使用0.5mol/L氢氧化钠溶液预处理中空纤维2-4小时，连接管路，浓缩过程中进液泵压力及出液压力不得超过0.1KMa，将20000mL含α毒素的滤过液原液浓缩至1000mL时，用pH7.6-7.8的PBS液进行洗滤，洗滤后总体积达2000mL时停止，即完成α毒素的10倍浓缩。用浓缩的牛A型产气荚膜梭菌α毒素可配制氢氧化铝胶苗，配制方法为：制备胶水(胶水是指氢氧化铝胶生理盐水溶液，配方为铝胶：生理盐水体积比为5：1)，高压灭菌后，将α毒素与胶水按体积比4：1-5：1混合，充分摇匀后，无菌分装。该氢氧化铝胶苗也属于本专利技术。本专利技术的另一目的是提供一种制备上述牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeA灭活类毒素疫苗的方法。本专利技术所提供的制备上述牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的方法，可包括以下步骤：制备牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeA灭活类毒素疫苗的方法，包括以下步骤：1)菌液制备：用权利要求7所述牛A型产气荚膜梭菌菌株CNM0708为菌种，按1-2％(体积比)加入到权利要求8所述专用培养基中，36-37℃下静置培养5-7小时，得到α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液；2)菌液灭活：向A型产气荚膜梭菌培养菌液中加入其体积比0.3-0.5％的甲醛溶液，37℃保持2-3天，期间每日搅拌2-3次；3)除菌体：先在4℃、6000-8000rpm下对灭活的菌液离心20-30min，再使用0.45μm级过滤器对离心上清液过滤去除菌体，留滤过液；4)浓缩α毒素：使用孔径3-5KD的中空纤维柱将步骤3)除菌体后溶液中的α类毒素浓缩10-20倍；5)制苗：用浓缩的α类毒素配制氢氧化铝胶苗的方法为：将氢氧化铝胶和生理盐水按体积比5：1制备胶水，高压灭菌后，将浓缩的α类毒素与胶水按体积比4:1-5:1(优选5：1)混合、摇匀，得到氢氧化铝胶苗；6)将氢氧化铝胶苗无菌分装，得到牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeA灭活类毒素疫苗。本专利技术提供了一种使用产毒水平较高、免疫原性良好、培养特性稳定的牛源A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeA菌株CNM0708CGMCCNo.14880制备牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的方法。通过优化培养基配方及培养条件，提高了培养稳定性和基础抗原效价，获得了高MLD水平的α毒素液；摸索出适宜的灭活、离心及过滤除菌参数，以及一种更安全、便捷、高效的α毒素浓缩方式，即选用膜孔径为3-5KD的中空纤维柱，提升了α毒素回收率，降低了培养成本，获得了较传统硫酸铵浓缩方式更安全(无任何副反应)、低损失率的浓缩抗原；使用高含量类毒素抗原制苗，通过提高配苗用α毒素剂量至适宜水平，获得了一种安全性好、高效力、低免疫剂量的牛A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。将该苗试用于三个不同的种牛、奶牛场，免疫1000多头牛，一免后即可使不同品种牛均产生高效价中和抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，是以免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌菌株作为制苗用菌种，用专用培养基培养获得α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液，菌液经灭活、除菌、α毒素浓缩、制苗，得到牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗。

【技术特征摘要】
1.牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，是以免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌菌株作为制苗用菌种，用专用培养基培养获得α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液，菌液经灭活、除菌、α毒素浓缩、制苗，得到牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗。2.根据权利要求1所述的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，其特征在于：所述免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeA菌株为分离于内蒙古呼和浩特土左旗牛场猝死后围产期及产后奶牛病料、具有α毒素致死性的菌株，命名为CNM0702株、CNM0708株、CNM0715株、CNM0730株和CNM0732株。3.根据权利要求1或2所述的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，其特征在于：所述牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeA菌株为CNM0708株，其保藏编号为CGMCCNo.14880。4.根据权利要求1或2或3所述的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，其特征在于：所述专用培养基配方为：将上述成分用水溶解后，调pH值至8.0-8.5，灭菌，使用时加入培养基体积0.5-1％的葡萄糖。5.根据权利要求1-4所述的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗，其特征在于：所述浓缩过程使用膜孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩α类毒素。6.牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeA菌株，用作牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗生产中的菌种，其特征在于：为分离于内蒙古呼和浩特土左旗牛场猝死后围产期及产后奶牛病料、具有α毒素致死性的菌株，命名为CNM0702株、CNM0708株、CNM0715株、CNM0730株和CNM0732株。7.保藏编号为CGMCCNo.14880的牛A型产气荚膜梭菌ClostridiumperfringenstypeACNM0708。8.权利要求1至5任一所述牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗生产中的专用培养基，其配方为：将上述成分用水溶解后，调pH值至8.0-8.5，灭菌，使用时加入培养基体积0.5-1％的葡萄糖。9.权利要求1-5任一所述的牛A型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗的制备方法，是以所述免疫原性良好的牛A型产气荚膜梭菌菌株作为制苗用菌种，用所述专用培养基在适宜培养条件下培养获得α毒素含量高的A型产气荚膜梭菌培养菌液，菌液经灭活、除菌体、用膜孔径3-5KD的中空纤维柱浓缩α类毒素、制苗，得到牛A型产气荚膜梭菌Clostridiumpe...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩四娥，刘国英，魏学峰，范秀丽，郝鹏，史文瑞，陈光达，黄海碧，张志丹，杨富贵，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15