一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法技术

本发明专利技术涉公开了一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法，包括以下过程：新鲜铁皮石斛枝条真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛备用；按新版《中国药典》铁皮石斛含量测定方法，称定样品粉末0.3 g，加入蒸馏水200 mL，水浴回流2 h，趁热过滤，定容到250 mL，得到铁皮石斛总多糖提取液T，在总多糖提取液T中，加入等体积的Tris‑马来酸盐缓冲液进行“水提‑α淀粉酶处理‑一次醇沉”处理，其结果《中国药典》法比较，总多糖、葡萄糖、甘露糖含量分别下降了20.9%、58.8%、1.6%。说明本技术方案可有效去除淀粉，操作简单、重复性好，适用于铁皮石斛等含淀粉药材的特殊多糖含量测定，对指导优质药材的生产、加工具有重要的理论与应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法
本专利技术涉及到一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法，属生物

技术介绍
铁皮石斛（DendrobiumcatenatumLindl.）是一种传统的名贵药材，以新鲜或干燥茎入药，具有滋阴清热，益胃生津的功效。现代生物技术研究表明，以葡甘聚糖为主的铁皮石斛水溶性非淀粉多糖是铁皮石斛茎中的主要活性成分，具有抗氧化，免疫调节，抗肿瘤等作用，其降解产生的甘露糖通过抑制葡萄糖代谢从而抑制肿瘤细胞的生长已经得到科学验证。然而，铁皮石斛植物体中这种有效成份的含量，因其品种、栽培环境等因素的影响而具有明显的差异，从而导致铁皮石斛药效品质不同。铁皮石斛植株体中有效成份的含量，直接影响到铁皮石斛产品的品质，因此，在中药学方面就有道地药材之说。现有铁皮石斛的质量评估，多以铁皮石斛外观指标进行。2015年版《中国药典》采用水提醇沉法提取总多糖溶液并测定铁皮石斛多糖含量，提出了一种以铁皮石斛有效成份含量作为指标的质量评价指标。然而实践结果表明，这种水提醇沉法所得的结果包含了淀粉类多糖和铁皮石斛水溶性非淀粉多糖，影响了铁皮石斛质量的科学评价。因此有必要获得一种能减少淀粉干扰的铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法。
技术实现思路
为解决现有铁皮石斛水溶性非淀粉多糖测定过程中淀粉干扰铁皮石斛水溶性非淀粉多糖含量测定的技术问题，本专利技术提出了一种新的测定方法。本专利技术是通过下述方式实现的：一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法，包括下述过程：步骤1：取新鲜铁皮石斛枝条真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛备用；步骤2：按照2015年版《中国药典》铁皮石斛含量测定方法，每个单位精密称定样品粉末0.3g，加入蒸馏水200mL，水浴回流2h，趁热过滤，定容到250mL，得到铁皮石斛总多糖提取液T；其特征在于还包括下述过程：步骤3：吸取步骤2所得的总多糖提取液T4mL，加入等体积的10mMTris-马来酸盐缓冲液，静置30至35min后置于沸水浴中7至10min，冷却，于35至40℃水浴平衡10min；步骤4：加入100U·mL-1α-淀粉酶溶液0.4mL，40℃孵育1h，再加入α-淀粉酶溶液0.2mL，40℃孵育0.5h；步骤5：加入4倍体积的无水乙醇，-20℃冷藏过夜，离心，上清液留用，沉淀加冷80%乙醇20mL离心2次，沉淀加热水溶解，定容至50mL，即制得铁皮石斛水溶性非淀粉多糖溶液S。由于本专利技术提出了“水提-α淀粉酶处理-一次醇沉”处理方法，在本实验中实测得0.3克的铁皮石斛中非淀粉多糖含量为374.4mg·g-1，与2015年版《中国药典》法比较，总多糖、葡萄糖、甘露糖含量分别下降了20.9%、58.8%、1.6%。建立的“水提-α-淀粉酶处理-一次醇沉”提取法与药典法相比，可以有效去除淀粉，操作简单、重复性好，适用于铁皮石斛等含淀粉药材的特殊多糖含量测定，对指导优质药材的生产、加工具有重要的理论与应用价值。附图说明图1淀粉与铁皮石斛多糖碘-碘化钾显色试验；图2不同浓度的α-淀粉酶处理铁皮石斛样品后碘-碘化钾显色反应吸光度值；图3铁皮石斛多糖中单糖组分的HPLC图。图中：A.2.5mg·mL-1淀粉；B.铁皮石斛粉末；C.药典法提取的多糖溶液；D.0.006U·mL-1α-淀粉酶预处理制得的多糖溶液；E.15U·mL-1α-淀粉酶预处理制得的多糖溶液；F蒸馏水。1.甘露糖；2.鼠李糖；3.葡萄糖醛酸；4.半乳糖醛酸；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.木糖；8.阿拉伯糖。具体实施方式实施方式1实验仪器：Agilent1200高效液相色谱系统（DAD检测器）；光吸收酶标仪SpectraMax190（美国MolecularDevices）；D-37520型高速离心机（德国Heraeus）；ALPHA1-2LDPlus冻干机（德国Christ）。实验试剂：α-淀粉酶（批号：10080）购于美国Sigma公司；D-甘露糖（批号：B21895）、L-鼠李糖（批号：B21172）、D-半乳糖醛酸（批号：B21894）、D-葡萄糖（批号：B21882）、D-木糖（批号：B21880）D-半乳糖（批号：YY91011）、D-阿拉伯糖（批号：YY91244）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司；D-葡萄糖醛酸（批号：140648-200602）对照品均购于中国药品生物制品检定所；可溶性淀粉（直链淀粉AR）（批号：20140714）购于国药集团化学试剂有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（批号：C10092148）购于上海麦克林生化科技有限公司；碘（批号：B1425040）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；碘化钾（批号：1206211）购于西陇化工股份有限公司；水为去离子水，乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。供试材料：2018年5月9日采集浙江省临安市天目山镇横塘村麻泥角弄（东经119°26′11″，北纬30°20′30″，海拔280米）梨树附生的铁皮石斛C15品系茎（树木枝叶遮阴，遮阴度70%-80%，光强为3000-5000lx），真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛备用。实验方法：总多糖提取液制备：按照药典法铁皮石斛含量测定项下方法，精密称定样品粉末0.3g，加入蒸馏水200mL，水浴回流2h，趁热过滤，定容至250mL，以80%乙醇终浓度进行沉淀，沉淀定容至50mL，制得总多糖提取液。非淀粉多糖溶液制备：方法A（二次醇沉）：取总多糖提取液4mL，加入等体积的10mMTris-马来酸盐缓冲液，静置30min后置于沸水浴中7min，冷却，于40℃水浴平衡10min，加入100U·mL-1α-淀粉酶溶液0.4mL，40℃孵育1h，再加入α-淀粉酶溶液0.2mL，40℃孵育0.5h；两次酶处理使其终浓度达15U·mL-1。加入4倍体积的无水乙醇，-20℃冷藏过夜，离心，沉淀加冷80%乙醇20mL离心2次，沉淀加热水溶解，定容至50mL，即制得非淀粉多糖溶液。方法B（一次醇沉）：精密称定样品粉末0.3g，加入蒸馏水200mL，水浴回流2h，趁热过滤，定容至250mL，摇匀静置；吸取该水提液4mL，自“加入等体积的10mMTris-马来酸盐缓冲液”起，同方法A。基于葡萄糖的标准曲线制备：配制浓度为0.01~0.10mg·mL-1的葡萄糖标准液，采用苯酚-硫酸法显色，于488nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得其回归方程为Y=6.1395X+0.0030，R2=0.9990。苯酚硫酸法测定样品多糖含量：精密量取供试品溶液1mL，照[0015]段所述的方法测定吸光度并计算多糖含量。单糖组成及含量测定：采用PMP柱前衍生-HPLC法分析铁皮石斛多糖中单糖的组成和含量：分别吸取总多糖提取液和方法B所得的非淀粉多糖溶液1mL，进行多糖酸水解及衍生化产物的制备。色谱条件为VenusilMPC18（4.6×300mm，5µm）色谱柱；流动相0.02mol·L-1乙酸铵-乙腈（17：83），柱温35℃，流速1.0mL·min-1，检测波长250nm，进样量25µL。淀粉标准曲线的制备：配制浓度为0.1~1.0mg·mL-1的淀粉标准液，采用碘-碘化钾显色法，于580nm处测定吸光度，以淀粉浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法，包括下述过程：步骤1：取新鲜铁皮石斛枝条真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛备用；步骤2：按照2015年版《中国药典》铁皮石斛含量测定方法，每个单位精密称定样品粉末0.3 g，加入蒸馏水200 mL，水浴回流2 h，趁热过滤，定容到250 mL，得到铁皮石斛总多糖提取液T；其特征在于还包括下述过程：步骤3：吸取步骤2所得的总多糖提取液T 4 mL，加入等体积的10 mM Tris‑马来酸盐缓冲液，静置30至35min后置于沸水浴中7至10min，冷却，于35至40 ℃水浴平衡10 min；步骤4：加入100 U·mL‑1 α‑淀粉酶溶液0.4 mL ，40 ℃孵育1 h，再加入α‑淀粉酶溶液0.2 mL ，40 ℃孵育0.5 h；步骤5：加入4倍体积的无水乙醇，‑20 ℃冷藏过夜，离心，上清液留用，沉淀加冷80%乙醇20 mL离心2次，沉淀加热水溶解，定容至50 mL，即制得铁皮石斛水溶性非淀粉多糖溶液S。

【技术特征摘要】
1.一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法，包括下述过程：步骤1：取新鲜铁皮石斛枝条真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛备用；步骤2：按照2015年版《中国药典》铁皮石斛含量测定方法，每个单位精密称定样品粉末0.3g，加入蒸馏水200mL，水浴回流2h，趁热过滤，定容到250mL，得到铁皮石斛总多糖提取液T；其特征在于还包括下述过程：步骤3：吸取步骤2所得的总多糖提取液T4mL，加入等体积的10mMTris...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯金平，刘京晶，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33