一种PD-L1外泌体的体外快速检测平台及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种PD‑L1外泌体的体外快速检测平台及检测方法，属于快速检测技术领域。检测平台包括样品初滤区、纳滤区、显色物垫区、显色区和吸水垫区。所述显色区上的捕获抗体和显色物垫区上的显色物标记抗体中至少有一种为外泌体PD‑L1抗体。检测方法为先将待检样品经过初滤膜进行初步过滤，再经过纳滤膜进行过滤，得到外泌体；外泌体与显色物标记抗体特异性地结合，与显色物标记抗体特异性结合的外泌体再与捕获抗体结合，形成双抗体夹心；所述捕获抗体和显色物标记抗体至少有一种为外泌体PD‑L1抗体。此平台集成全血分离，外泌体纯化以及PD‑L1外泌体特异检测，具有操作方便，检测快捷，以及成本低等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种PD-L1外泌体的体外快速检测平台及检测方法
本专利技术属于快速检测
，具体涉及一种PD-L1外泌体的体外快速检测平台及检测方法。
技术介绍
外泌体是细胞分泌到胞外微环境中的纳米级小囊泡(直径50-150nm)，在1983首次被发现。但由于分析手段的缺乏，长期以来外泌体被认为是细胞排泄胞内垃圾的工具。随着分析方法的不断创新，外泌体分泌的机制逐渐被揭示。现在，科学界主流的观点认为，外泌体主要参与细胞间的信号传递以及作为疾病标记物。2013年诺贝尔生理医学奖授予了揭示这一领域重大发现的三位杰出科学家。然而，由此引发的外泌体功能研究与未来潜在应用给国际学术界带来无限遐想。2015年，借助活体成像技术，外泌体等胞外膜泡在体内广泛传递获得证实；而更激动人心的发现，外泌体正颠覆科学界对癌症发育的认知：传统观点认为，肿瘤转移是由于原发灶肿瘤细胞通过血液循环系统直接落户到其他组织。这导致了时下循环肿瘤细胞研究盛况空前；在正常情况下，T细胞鉴别到癌细胞后使癌细胞自动裂解，维持人体的平衡。但是癌细胞表面表达一种特殊的蛋白质(受体)，和T细胞结合，令T细胞产生“错觉”，认为癌细胞是“无害的”，同时使得T细胞的活性降低，癌细胞获得自救。这种特殊的蛋白质就是PD-L1(程序性死亡受体-1的配体)。但最新的外泌体分析发现，肿瘤是首先分泌外泌体作为先锋队，通过血液循环系统传送到其他组织，并改造微环境使其适应肿瘤细胞生长后，再排遣肿瘤细胞大军安营扎寨。这一发现再次刷新或颠覆了我们对癌症的认识，百年来关于癌症的“种子”和“土壤”假说终于获得印证。令人振奋的是，最近陈刚副教授在其研究中发现，肿瘤细胞可通过释放表面富含PD-L1的外泌体发挥对肿瘤杀伤性T细胞的功能抑制作用，且外周血中PD-L1阳性外泌体的浓度水平与肿瘤大小呈密切正相关(Nature,2018,560(7718):382-386)。因此，开发一种基于外泌体PD-L1蛋白的体外快速检测平台及方法，对于肿瘤无创诊断以及实时疗效检测，将具有重要的意义。文献检索发现，Blanco-López等人2016年就提出了一种基于试纸条的外泌体检测平台，简单有效，但其外泌体分离仍需超离，费时费力(JournalofExtracellularVesicles5(2016):3180；BiosensorsandBioelectronics87(2017):38–45)。检索专利发现，王国胜等人也提出了一种外泌体即时检测平台(申请号201811060763)，其中利用纳米芯片技术实现外泌体分离纯化，理论可行，但加工和操作复杂，分离芯片如何与试纸条整合也是难点。同时文献及专利中多数是基于检测外泌体表面的四跨膜超家族蛋白(CD63/CD9/CD81等)，正常细胞分泌的外泌体表面也携带四跨膜超家族蛋白，所以目前大多数外泌体检测目的是基于外泌体丰度检测，并不具有特异性。
技术实现思路
本专利技术解决了现有技术中外泌体检测特异性不高、操作不便以及成本高的技术问题。按照本专利技术的第一方面，提供了一种PD-L1外泌体的体外检测平台，包括：样品初滤区：所述样品初滤区上粘贴有初滤膜，所述初滤膜用于初步过滤样品，截留所述样品中直径大于初滤膜直径的细胞和/或颗粒物；纳滤区：所述纳滤区与所述样品初滤区连接；所述纳滤区上粘贴有纳滤膜，所述纳滤膜用于分离得到外泌体；显色物垫区：所述显色物垫区与所述纳滤区连接；所述显色物垫区用于固定显色物标记抗体，且能使显色物标记抗体与样品复溶；所述显色物标记抗体用于与外泌体特异性地结合；显色区：所述显色区与所述显色物垫区连接；所述显色区为硝酸纤维素膜上固定捕获抗体和对照抗体；所述捕获抗体为外泌体抗体，且所述捕获抗体和显色物标记抗体中至少有一种为外泌体PD-L1抗体；所述对照抗体能与显色物标记抗体结合，所述对照抗体用于判定显色区的有效性；吸水垫区：所述吸水垫区与所述显色区连接，所述吸水垫区用于固定吸水垫；所述吸水垫用于为层析提供动力。优选地，所述初滤膜为玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜或聚酯纤维素膜。优选地，所述纳滤膜滤孔的直径为150nm-250nm；所述纳滤膜为亲水聚碳酸酯膜。优选地，所述显色物标记抗体上的显色物为胶体金、荧光染料、荧光纳米微球和纳米酶中的至少一种。按照本专利技术的另一方面，提供了显色物标记抗体和捕获抗体用于制备检测PD-L1外泌体试剂中的应用，含有以下步骤：(1)将待检测样品经过初滤膜进行初步过滤，截留样品中直径大于初滤膜直径的细胞和/或颗粒物；再经过纳滤膜进行过滤，得到外泌体；(2)步骤(1)得到的外泌体与显色物标记抗体特异性地结合，与显色物标记抗体特异性结合的外泌体再与捕获抗体结合，形成双抗体夹心；所述捕获抗体和显色物标记抗体至少有一种为外泌体PD-L1抗体；若对照抗体处显色且捕获抗体处显色，所述待检测样品即为PD-L1外泌体阳性样品；若对照抗体处显色且捕获抗体处不显色，所述待检测样品即为PD-L1外泌体阴性样品。优选地，所述初滤膜为玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜或聚酯纤维素膜。优选地，所述纳滤膜的直径为150nm-250nm；所述纳滤膜为亲水聚碳酸酯膜。优选地，所述显色物标记抗体上的显色物为胶体金、荧光染料、荧光纳米微球和纳米酶中的至少一种。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：(1)本专利技术集成全血分离，外泌体纯化以及PD-L1外泌体特异性检测，具有操作方便，检测快捷，特异性高，以及成本低等有益效果。(2)本专利技术采用两级过滤，即初滤及纳滤，通过物理尺寸效应，从全血样品中直接快速的获取外泌体，克服了传统超速离心方法费时费力的缺点。(3)本专利技术借助PD-L1抗体，特异性识别带有PD-L1蛋白的外泌体，克服了已有借助四跨膜超家族蛋白抗体的特异性低的缺点。(4)本专利技术优选的显色物为荧光染料、荧光纳米微球或纳米酶，再依据荧光染料或荧光纳米微球上的发光情况计算出PD-L1外泌体的含量，或者依据纳米酶的催化性能计算出PD-L1外泌体的含量。附图说明图1是本专利技术实施例1提供的PD-L1外泌体的体外快速检测平台及方法流程图。图2是本专利技术实施例6提供的PD-L1外泌体的体外快速检测平台。在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1-样品初滤区，2-纳滤区，3-显色物垫区，4-硝酸纤维素膜，5-捕获抗体显色区，6-对照抗体显色区，7-吸水垫区，8-支持垫，9-第二捕获抗体显色区。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下面结合附图详细说明本专利技术的优选实施方式。实施例1PD-L1外泌体的体外快速检测平台及方法，包括：样品初滤区1：所述样品初滤区为玻璃纤维素进行全血的初步过滤，截留大部分的血细胞；纳滤区2：纳滤区2与所述样品初滤区1连接；所述纳滤区2为纳米亲水滤膜，实现上一步残留血细胞的进一步拦截，同时实现外泌体分离；纳米滤膜的直径为150nm。显色物垫区3：所述显色物垫区3与纳滤区2连接；所述显色物垫区本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PD‑L1外泌体的体外检测平台，其特征在于，包括：样品初滤区：所述样品初滤区上粘贴有初滤膜，所述初滤膜用于初步过滤样品，截留所述样品中直径大于初滤膜直径的细胞和/或颗粒物；纳滤区：所述纳滤区与所述样品初滤区连接；所述纳滤区上粘贴有纳滤膜，所述纳滤膜用于分离得到外泌体；显色物垫区：所述显色物垫区与所述纳滤区连接；所述显色物垫区用于固定显色物标记抗体，且能使显色物标记抗体与样品复溶；所述显色物标记抗体用于与外泌体特异性地结合；显色区：所述显色区与所述显色物垫区连接；所述显色区为硝酸纤维素膜上固定捕获抗体和对照抗体；所述捕获抗体为外泌体抗体，且所述捕获抗体和显色物标记抗体中至少有一种为外泌体PD‑L1抗体；所述对照抗体能与显色物标记抗体结合，所述对照抗体用于判定显色区的有效性；吸水垫区：所述吸水垫区与所述显色区连接，所述吸水垫区用于固定吸水垫；所述吸水垫用于为层析提供动力。

【技术特征摘要】
1.一种PD-L1外泌体的体外检测平台，其特征在于，包括：样品初滤区：所述样品初滤区上粘贴有初滤膜，所述初滤膜用于初步过滤样品，截留所述样品中直径大于初滤膜直径的细胞和/或颗粒物；纳滤区：所述纳滤区与所述样品初滤区连接；所述纳滤区上粘贴有纳滤膜，所述纳滤膜用于分离得到外泌体；显色物垫区：所述显色物垫区与所述纳滤区连接；所述显色物垫区用于固定显色物标记抗体，且能使显色物标记抗体与样品复溶；所述显色物标记抗体用于与外泌体特异性地结合；显色区：所述显色区与所述显色物垫区连接；所述显色区为硝酸纤维素膜上固定捕获抗体和对照抗体；所述捕获抗体为外泌体抗体，且所述捕获抗体和显色物标记抗体中至少有一种为外泌体PD-L1抗体；所述对照抗体能与显色物标记抗体结合，所述对照抗体用于判定显色区的有效性；吸水垫区：所述吸水垫区与所述显色区连接，所述吸水垫区用于固定吸水垫；所述吸水垫用于为层析提供动力。2.如权利要求1所述的PD-L1外泌体的体外检测平台，其特征在于，所述初滤膜为玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜或聚酯纤维素膜。3.如权利要求1所述的PD-L1外泌体的体外检测平台，其特征在于，所述纳滤膜滤孔的直径为150nm-250nm；所述纳滤膜为亲水聚碳...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘笔锋，陈鹏，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42