本发明专利技术提供一种检测沙门菌invA基因的金纳米比色传感器，选用沙门菌高度保守的invA基因，设计与其特异性结合的探针，结合核酸循环放大技术，基于其信号放大作用，利用比色技术检测沙门菌invA基因，使得检测的线性范围达到0.74 pM～10 pM。本发明专利技术构建了简单、快速灵敏检测沙门菌的方法，在检测上不需要昂贵的仪器设备，具有检测简便快速、灵敏度高、检测成本低和现场检测等特点。
A Gold Nanometer Colorimetric Sensor for Detecting Salmonella invA Gene
The present invention provides a gold nanometer colorimetric sensor for detecting invA gene of Salmonella. The highly conservative invA gene of Salmonella is selected, and a probe specifically binding to it is designed. Combining with nucleic acid cyclic amplification technology, based on its signal amplification, the invA gene of Salmonella is detected by colorimetric technology, so that the linear range of detection reaches 0.74 pM-10 pM. The invention has the advantages of simple, rapid and sensitive detection method for Salmonella, no expensive instruments and equipment are needed in detection, simple and fast detection, high sensitivity, low detection cost and on-site detection.
【技术实现步骤摘要】
一种检测沙门菌invA基因的金纳米比色传感器
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种检测沙门菌invA基因的金纳米比色传感器。
技术介绍
沙门氏菌属肠杆菌科，是革兰阴性肠道杆菌，它是食源性疾病中最重要的致病菌之一。沙门氏菌感染后主要引起食物中毒、胃肠炎、伤寒和副伤寒。有研究表明，沙门氏菌的侵袭蛋白与其致病性密切相关，决定着细菌进入宿主上皮细胞的能力。它主要由一系列基因编码，其中invA是编码沙门菌侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门菌特有的。目前，最常用的肠道致病菌检测方法主要有三种：传统的分离培养鉴定、酶联免疫吸附法(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)。传统的分离培养鉴定法是将细菌分离培养后通过菌落计数和菌落形态、染色特征、生化反应等方法对细菌进行鉴定，该方法是细菌鉴定的金标准方法，但是其耗时费力。ELISA方法是基于抗原抗体反应的免疫学检测，与传统的分离培养鉴定方法相比较，缩短了检测时间，但是仍然需要细菌培养这一步，至少需要24～48小时才能得出准确的结果，而且该方法的检测限一般为≥105CFUmL-1，难以满足低浓度细菌的检测。PCR技术与上述两种方法相比较，优点是较高的灵敏度，但是PCR结果容易出现假阳性；目前实验室主要用凝胶电泳技术来检测PCR扩增的片段，但是凝胶电泳技术的分辨率较低且需要较高精确度的热循环仪，因此限制了PCR技术在实验室检测细菌的广泛运用。另一方法，不使用热循环仪的核酸依赖的扩增(NASBA)和自主序列复制系统(ASR)，在特异性上又大打折扣，主要是由于必须用一个相对较低的温度40℃来进行扩增。链置换扩增术(SDA)利用四种引物在等温条件下扩增，很大程度上克服了这些缺陷，但是仍然存在薄弱的环节：必须利用昂贵的修饰核苷酸作为底物来进行扩增反应。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测沙门菌invA基因的金纳米比色传感器，用于沙门菌invA基因的检测具有简便快速、灵敏度高、检测成本低等优点。本专利技术的目的是这样实现的：一种检测沙门菌invA基因的金纳米比色传感器，包括核酸循环放大反应体系和金纳米粒子聚集体系，其特征在于：所述核酸循环放大反应体系中包括针对沙门菌invA基因的茎环模板H1、辅助茎环模板H2和缓冲体系；所述茎环模板H1的序列如SEQIDNO：1所示，所述辅助茎环模板H2的序列如SEQIDNO：2所示。SEQIDNO：1(茎环模板H1)：5’-ATCGCATTTGAATGGACTAGGATCAAATGCGAATTCCTAGAGACTGATTGGTT-3’。SEQIDNO：2(辅助茎环模板H2)：5’-ATGGACTAGGAATCGCATTTGATCCTAGTCCATTCAAATAGAACTGATTGGTT-3’。检测原理：本专利技术采用特定的茎环模板(H1)以实现对沙门菌invA基因的高特异性识别，通过核酸循环放大反应以及金纳米粒子聚集显色现象实现对沙门菌invA基因高灵敏的检测(图1)。具体的，金纳米粒子表面结合有特定的茎环模板(H1)，H1含有与沙门菌invA基因T(2，3，4片段)完全互补序列2’，3’，4’片段。当沙门菌invA基因T存在时，T将与金纳米粒子表面茎环模板H1结合并打开H1形成H1-T复合物，暴露H1结构中封闭的1，2片段，H1-T复合体可进一步与辅助茎环模板(H2)中的2，3，4，2’，1’片段发生特异性杂交反应形成H1-H2复合体，并将沙门菌invA基因T通过链置换反应释放出来继续与另一个金纳米表面的H1结构发生反应。H1-H2复合体的形成使得金纳米之间的距离缩短发生聚集并产生颜色变化，如此循环往复形成大量金纳米聚集现象。通过紫外分光光度计测得其在700nm和522nm处的吸光度比值实现对沙门菌invA基因的检测。在本专利技术信号放大反应体系中，所述缓冲体系选自磷酸盐缓冲液(10mM，0.01％十二烷基硫酸钠[SDS]，0.3MNaCl，pH7.5)。进一步，在本专利技术核酸循环放大反应体系中，所述茎环模板(H1)与辅助茎环模板(H2)的浓度为20～200nM；反应体系的反应时间为1～2h。更进一步，在本专利技术核酸循环放大反应体系中，所述茎环模板(H1)与辅助茎环模板(H2)的最佳浓度为20nM，反应体系的反应时间为2h。有益效果本专利技术提供了一种检测沙门菌invA基因的金纳米比色传感器，选用沙门菌高度保守的invA基因，设计与其特异性结合的探针，结合核酸循环放大技术，基于其信号放大作用，利用比色技术检测沙门菌invA基因，使得检测的线性范围达到0.74pM～10pM。本专利技术构建了简单、快速灵敏检测沙门菌的方法，在检测上不需要昂贵的仪器设备，具有检测简便快速、灵敏度高、检测成本低和现场检测等特点。附图说明图1是检测原理示意图；图2是核酸循环放大反应中的H1-H2复合体的形成用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证图；图3是不同浓度的沙门菌invA基因的吸光度变化图；图4是沙门菌invA基因的线性方程图。实施例为了使本专利技术的目的和技术方案更加清楚，下面对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。要说明的是：以下实施例只用于对本专利技术进行进一步的说明，而不能理解为对本专利技术保护范围的限制。本领域的技术人员根据本专利技术的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所用原料与试剂均为市售产品。材料：HAuCl4，HPLC纯化的DNA由上海生工生物工程有限公司提供。检测仪器：紫外分光光度计UV-2550(日本岛津)。实施例1提取用作PCR模板的基因组DNA由于沙门菌感染很多是食源性的，因此通常可以用食品或者粪便作为检测源。用食品检测：在无菌条件下进行操作，将待检食品放入匀浆机中搅成匀浆，取25g(或mL)待检样品的匀浆用225mL缓冲蛋白胨水(BP)稀释成1∶10的均质匀浆液。取1mL均质匀浆液置于离心管中，12000r/min离心5min，灭菌生理盐水洗涤2次，最后用0.25mL蒸馏水悬浮，置于100℃水浴中孵育15分钟然后立即置于冰中。在4℃以12000r/min离心10分钟后，将上清液转移至新管中，该上清液中即含有可以直接用作PCR模板的基因组DNA。用粪便检测：取腹泻患者粪便标本200mg，使用QIAampDNAStoolMiniKit(QiagenInc.，Valencia，CA，USA，CatNo.51504)试剂盒进行DNA的分离提取，具体步骤按照试剂盒说明书操作。实施例2扩增得到待检的PCR产物样品配制PCR反应液，含有：取实施例1中来源于食品或者粪便的含有基因组DNA的上清液5.0μL，20μM的正反向引物各1.0μL，25μL的PremixTaq(1.25UDNApolymerase，2×Taqbuffer，0.4mMdNTPs)和18μL水，PCR反应的最终体积为50μL。根据沙门菌高度保守的invA基因，利用NCBI网站的PrimerBlast模块设计invA基因的扩增引物，正向引物序列为：5’-GCATCCGCATCAATAATACCG-3’，反向引物序列为：5’-TTCTCTGGATGGTATGCCC-3’。PCR反应条件如下：95℃预变性1分钟；接着95℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃引物延伸30本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测沙门菌invA基因的金纳米比色传感器，包括核酸循环放大反应体系和金纳米粒子聚集体系，其特征在于：所述核酸循环放大反应体系中包括针对沙门菌invA基因的茎环模板H1、辅助茎环模板H2和缓冲体系；所述茎环模板H1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述辅助茎环模板H2的序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.一种检测沙门菌invA基因的金纳米比色传感器，包括核酸循环放大反应体系和金纳米粒子聚集体系，其特征在于：所述核酸循环放大反应体系中包括针对沙门菌invA基因的茎环模板H1、辅助茎环模板H2和缓冲体系；所述茎环模板H1的序列如SEQIDNO：1所示，所述辅助茎环模板H2的序列如SEQIDNO：2所示。2.如权利要求1所述金纳米比色传感器，其特征在于：所述缓冲体系选自磷酸盐缓冲液(10mM，0.0...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐红兵，丁世家，杨玉妮，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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