一种沙门氏菌定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器制造技术

本发明专利技术公开了一种用于沙门氏菌定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器，该传感器的制备方法包括以下步骤：提取菌种DNA；开发与筛选RPA反应的引物；优化RPA反应的反应时间、反应温度，确定引物浓度；优化TdT反应条件。通过本发明专利技术的方法设计的无标记和可视化的用于灵敏的和选择性的检测沙门氏菌的级联放大的功能核酸传感器，可以在较短的时间内完成对沙门氏菌的特异性检测，具有可视化、高灵敏度和通用性强等优点。

A Visual Cascade Amplification Functional Nucleic Acid Sensor for Quantitative Detection of Salmonella

The invention discloses a visualized cascade amplification functional nucleic acid sensor for quantitative detection of Salmonella. The preparation method of the sensor includes the following steps: extracting strain DNA; developing and screening primers for RPA reaction; optimizing reaction time, reaction temperature, determining primer concentration of RPA reaction; and optimizing TdT reaction conditions. The labeled and visualized functional nucleic acid sensor for sensitive and selective detection of Salmonella cascade amplification designed by the method of the invention can complete the specific detection of Salmonella in a relatively short time, and has the advantages of visualization, high sensitivity and versatility.

【技术实现步骤摘要】
一种沙门氏菌定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器
本专利技术涉及食品检测
，具体是一种检测沙门氏菌的功能核酸传感器的制备方法及其应用。
技术介绍
沙门氏菌是一种杆状革兰氏阴性菌，是环境中主要的人兽共患病原菌之一。大部分沙门氏菌血清型能引起肠胃炎等疾病，据统计，美国有大约100万人因沙门氏菌导致肠炎，其中约450例死亡。少数血清型能引起肠热症，如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌A型、B型及C型等。沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，可由肉、蛋、奶、蛋糕、肉制品等众多营养丰富的食品进行传播。近年来，随着生物技术的快速发展，新技术新方法在食品微生物检验领域得到了广泛应用，沙门氏菌检测的检测方法也越来越多，但是这些方法大部分都是基于实验室大型仪器进行的，而且检测时间也较长。因此建立快速且灵敏的沙门氏菌的特异性检测方法十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测沙门氏菌的功能核酸传感器的制备方法及其应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种检测沙门氏菌的功能核酸传感器的制备方法，包括以下步骤：1、提取菌种DNA；2、开发与筛选RPA反应的引物；3、优化RPA反应的反应时间、反应温度，确定引物浓度；4、优化TdT反应条件；5、选择DSN反应缓冲液并优化反应时间；6、优化DSN的浓度并进行特异性分析。作为本专利技术进一步的方案：步骤1中，开发与筛选RPA反应的方法为：设计8对引物，按照5碱基平移的方法进行筛选，选出最适引物，8对引物的序列为：SAl-F1：GAAGCCTTGTTATCAGCCGCCGAACCTCGCTTATCSAl-R1：TGGAAAGTAACGTTTAGCTGCTGGATCAGCCGAAGSAl-F2：CTTGTTATCAGCCGCCGAACCTCGCTTATCGGAAASAl-R2：AGTAACGTTTAGCTGCTGGATCAGCCGAAGAAAGCSAl-F3：TATCAGCCGCCGAACCTCGCTTATCGGAAAGCTTTSAl-R3：CGTTTAGCTGCTGGATCAGCCGAAGAAAGCTTTGCSAl-F4：CCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGSAl-R4：CCTCAATACTGAGCGGCTGCTCGCCTTTGCTGGSAl-F5：CGAACCTCGCTTATCGGAAAGCTTTAGCCGTACTGSAl-R5：CTGGATCAGCCGAAGAAAGCTTTGCCTGTGGGGAASAl-F6：CTCGCTTATCGGAAAGCTTTAGCCGTACTGACTGGSAl-R6：TCAGCCGAAGAAAGCTTTGCCTGTGGGGAAGGTTASAl-F7：TTATCGGAAAGCTTTAGCCGTACTGACTGGTTGATSAl-R7：CGAAGAAAGCTTTGCCTGTGGGGAAGGTTAAGGAGSAl-F8：GGAAAGCTTTAGCCGTACTGACTGGTTGATGATTGSAl-R8：AAAGCTTTGCCTGTGGGGAAGGTTAAGGAGGGTGA。作为本专利技术进一步的方案：步骤2中，优化RPA反应的反应时间、反应温度，确定引物浓度的方法为：将反应时间梯度设置为：10min、20min、30min，经过RPA反应后，再进行琼脂糖凝胶电泳分析，通过对比不同反应时间条带的亮度确定反应时间和引物浓度。作为本专利技术进一步的方案：步骤4中，优化TdT反应条件的方法为：将反应时间梯度设置为：10min、20min、30min、40min，比较不同反应时间的延伸产物与TMB作用的显色结果和吸光值确定反应时间。作为本专利技术进一步的方案：步骤5中，选择DSN反应缓冲液并优化反应时间的方法为：将RPA扩增产物用1U/mL的DSN在37℃温度下进行切割，反应时间梯度设置为：15min、25min、35min，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析切割产物，确定反应缓冲液和反应时间。作为本专利技术进一步的方案：步骤6中，优化DSN的浓度的方法为：将产物在不同DSN反应浓度进行TdT延伸20min，形成G-四联体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，通过凝胶电泳图条带亮度确定DSN的最优浓度。作为本专利技术进一步的方案：基于上述方法制备的功能核酸传感器，用于食品现场安全评估。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：通过本专利技术的方法设计的无标记和可视化的用于灵敏的和选择性的检测沙门氏菌的级联放大的功能核酸传感器，可以在较短的时间内完成对沙门氏菌的特异性检测，该级联放大的功能核酸传感器具有以下几个优点：(1)双酶放大模块的设计：经过RPA扩增后，生成的沙门氏菌DNA被DSN切割形成大量具有3’-OH的dsDNA，可作为TdT延伸的模板，通过双酶的作用将沙门氏菌的含量转化为视觉信号输出，并伴随着检测信号的级联扩增；(2)可视化：TdT在核酸尾部延伸后形成富G序列，然后诱导形成G-四联体结构与TMB结合可生成肉眼可见的蓝色实现定性分析，加入终止液后在450nm处进行吸光度的测量可以实现定量分析；(3)检测时间短和高灵敏度：我们构建的检测平台可以在100min左右实现对沙门氏菌的检测。并且沙门氏菌浓度在102-106cfu/mL范围内线性响应，可以实现单个细胞水平的检测；(4)通用性：我们构建的功能核酸传感器可以通过改变引物的序列，实现对其他致病菌的检测，其操作简单，检测时间短和肉眼可定性判断等优点，该功能核酸传感器具有良好的食品现场安全评估前景。附图说明图1为本专利技术中不同引物进行RPA扩增的电泳图；图2为本专利技术中不同浓度引物进行RPA扩增30min的电泳图；图3为本专利技术中不同浓度引物进行RPA扩增20min的电泳图；图4为本专利技术中不同浓度引物进行RPA扩增10min的电泳图；图5为本专利技术中反应温度为42℃时引物进行RPA扩增的电泳图；图6为本专利技术中将RPA扩增产物作为模板进行不同时间下TdT延伸的吸光值结果图；图7为本专利技术中将RPA扩增产物稀释4倍后作为模板进行不同时间下TdT延伸的吸光值结果图；图8为本专利技术中将RPA扩增产物稀释8倍后作为模板进行不同时间下TdT延伸的吸光值结果图；图9为本专利技术中不同条件下进行DSN切割的电泳图；图10为本专利技术中不同浓度DSN反应生成G-四联体的电泳图；图11为本专利技术中对RDTG反应的特异性分析的吸光度结果图；图12为本专利技术中检测沙门氏菌的灵敏度分析的吸光度结果图；图13为本专利技术的方法流程图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实验准备：1、提取DNA的提取采用热裂解的方法进行DNA提取，具体为：取1mL菌液于1.5mLEP管，在4℃条件下，以12000r/min离心5min，弃去上清液。再向管中加入1mLddH2O，12000r/min，5min，4℃，离心，弃去上清液，再加入50μLddH2O、混匀，并置于电热恒温水浴锅中99℃煮沸10min后，立即置冰上20mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于沙门氏菌定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)提取菌种DNA；2)开发与筛选RPA反应的引物；3)优化RPA反应的反应时间、反应温度，确定引物浓度；4)优化TdT反应条件；5)选择DSN反应缓冲液并优化反应时间；6)优化DSN的浓度并进行特异性分析。

【技术特征摘要】
1.一种用于沙门氏菌定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)提取菌种DNA；2)开发与筛选RPA反应的引物；3)优化RPA反应的反应时间、反应温度，确定引物浓度；4)优化TdT反应条件；5)选择DSN反应缓冲液并优化反应时间；6)优化DSN的浓度并进行特异性分析。2.根据权利要求1所述的一种检测沙门氏菌的功能核酸传感器的制备方法，其特征在于：步骤1中，开发与筛选RPA反应的方法为：设计8对引物，按照5碱基平移的方法进行筛选，选出最适引物，8对引物的序列为：SAl-F1：GAAGCCTTGTTATCAGCCGCCGAACCTCGCTTATCSAl-R1：TGGAAAGTAACGTTTAGCTGCTGGATCAGCCGAAGSAl-F2：CTTGTTATCAGCCGCCGAACCTCGCTTATCGGAAASAl-R2：AGTAACGTTTAGCTGCTGGATCAGCCGAAGAAAGCSAl-F3：TATCAGCCGCCGAACCTCGCTTATCGGAAAGCTTTSAl-R3：CGTTTAGCTGCTGGATCAGCCGAAGAAAGCTTTGCSAl-F4：CCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGSAl-R4：CCTCAATACTGAGCGGCTGCTCGCCTTTGCTGGSAl-F5：CGAACCTCGCTTATCGGAAAGCTTTAGCCGTACTGSAl-R5：CTGGATCAGCCGAAGAAAGCTTTGCCTGTGGGGAASAl-F6：CTCGCTTATCGGAAAGCTTTAGCCGTACTGACTGGSAl-R6：TCAGCCGAAGAAAGCTTTGCCTGTGGGGAAGGTTASAl-F7：TTATCGGAAAGCTTTAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云波，许文涛，田洪涛，张媛，田晶晶，黄昆仑，商颖，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11