一种DNA生物传感器及其应用于测定DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种DNA生物传感器及其应用于测定DNA的方法。本发明专利技术的关键点在于基底PDMS是柔性材料决定了电极的柔性特性，银纳米线具有较低的电阻，决定了电极的良好导电性能，银纳米线上纳米金颗粒紧密排列，为巯基单链DNA在金上的固定提供了较大的表面积，良好的导电性及较高的活性表面积是制备出高灵敏度电化学传感器的保证。本发明专利技术采用滴涂的方法制备出均匀分布的银纳米线导电层、然后采用电化学沉积的方法在银纳米线上沉积出纳米金颗粒，其最大的优势在于简单易行、不需要合成纳米金，解决了纳米金较难制备的问题，同时解决了电化学检测中金活性表面积小的问题。

A DNA biosensor and its application in DNA determination

The invention relates to a DNA biosensor and a method for determining DNA. The key point of the invention is that the base PDMS is a flexible material, which determines the flexible characteristics of the electrode. The silver nanowires have low resistance, which determines the good conductivity of the electrode. The gold nanoparticles on the silver nanowires are arranged closely, which provides a large surface area for the immobilization of sulfhydryl single strand DNA on gold. Good conductivity and high active surface area are the preparation of high sensitivity electrochemistry. Sensor assurance. The method of dropping coating is used to prepare uniformly distributed conductive layer of silver nanowires, and then gold nanoparticles are deposited on silver nanowires by electrochemical deposition method. The greatest advantage of the method is that it is simple and easy to synthesize nanogold, which solves the problem of difficult preparation of nanogold, and also solves the problem of small active surface area of gold in electrochemical detection.

【技术实现步骤摘要】
一种DNA生物传感器及其应用于测定DNA的方法
本专利技术涉及生物传感器制备和电化学分析
，具体涉及一种可用于DNA测定的新型电极的制备及测定方法。
技术介绍
DNA(deoxyribonucleicacid)脱氧核糖核酸，是调控生物遗传的重要物质。DNA片段中的特定核苷酸序列决定了基因的遗传特性，DNA变异可能会对生物体产生巨大危害。因此，建立一种简单、快速、灵敏、特异性强的DNA检测方法是十分有必要的。目前，常见的DNA检测技术有基因芯片技术、DNA测序技术、荧光光谱、表面增强拉曼散射、电化学检测等技术。其中，基因芯片技术、DNA测序技术、荧光光谱、表面增强拉曼散射所需仪器复杂昂贵，对人员操作要求较高，检测费时且仪器较大不便于现场检测。现今电化学中构建的DNA检测电极多为硬质材料，大小形状不易控制，限制了电极的广泛应用。纳米材质的复合金属应用较少，致使检测灵敏度不高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有柔性、较高灵敏度的新型银纳米线/纳米金柔性复合电极(AuNPs/AgNWs/PDMS电极)及应用该电极制备的DNA生物传感器及其应用于测定DNA的分析方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种DNA生物传感器。所述DNA生物传感器是将巯基DNA固定在AuNPs/AgNWs/PDMS电极上。所述AuNPs/AgNWs/PDMS电极的制备方法为：以PDMS为柔性基底，用2％的聚乙烯醇(PVA)与5％的丙三醇(Gly)混合溶液在其表面修饰亲水表层，在亲水修饰层上均匀涂上一层银纳米线导电层，以KAuCl4和H2SO4混合溶液为电解液，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极，银纳米线导电层为工作电极，采用计时电流法在该导电层上进行电化学沉积金，制备出AuNPs/AgNWs/PDMS电极。优选的，所述KAuCl4和H2SO4混合电解液中，KAuCl4浓度为0.01～0.05mol/L，H2SO4浓度为0.1～0.5mol/L。优选的，电化学沉积金电位为-0.2V，沉积时间为400～1600s。所述DNA生物传感器的制备方法为：(1)将所述AuNPs/AgNWs/PDMS电极浸入含有巯基单链DNA(SH-ssDNA)探针的PBS溶液中充分反应，然后把电极放入空白PBS中，恒温搅拌，以除去非特异性吸附的DNA分子，然后浸入巯基乙醇(MCH)中，进一步消除非特异性吸附DNA分子并获得相对致密的DNA单分子层，后用PBS溶液和二次蒸馏水冲洗干净，氮气干燥；(2)将巯基乙醇(MCH)修饰过的DNA探针电极浸入到不同浓度靶DNA的PBS溶液中，恒温水浴并搅拌，得到双链DNA(dsDNA)修饰电极，二次水和PBS溶液反复冲洗，以除去表面吸附的未杂交的靶DNA，氮气干燥，备用。优选的，巯基单链DNA浓度为10-7～10-8，双链DNA浓度为10-7～10-9。本专利技术的另一个目的是提供一种利用上述DNA生物传感器测定DNA的方法，ssDNA或dsDNA修饰电极的循环伏安信号的测定是在1mM亚甲基蓝(MB)的PBS(0.1MKCl)溶液中进行的。ssDNA或dsDNA修饰电极置于1mM的亚甲基蓝(MB)溶液中浸泡20min，确保亚甲基蓝(MB)和DNA链充分静电结合。然后，用二次蒸馏水、PBS(0.1M,pH7.4)溶液反复冲洗以去除电极表面上吸附的分子。然后，记录在PBS(0.1M,pH7.4)溶液中的循环伏安信号。优选的，循环伏安实验参数是:电位范围-0.6～0.6V；扫速100mV/s。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种导电性能好、检测灵敏度高的柔性电极。该电极制备工艺简单，易实现批量成产。本专利技术的关键点在于基底PDMS是柔性材料决定了电极的柔性特性，银纳米线具有较低的电阻，决定了电极的良好导电性能。银纳米线上纳米金颗粒紧密排列，为巯基单链DNA在金上的固定提供了较大的表面积。良好的导电性及较高的活性表面积是制备出高灵敏度电化学传感器的保证。本专利技术采用滴涂的方法制备出均匀分布的银纳米线导电层、然后采用电化学沉积的方法在银纳米线上沉积出纳米金颗粒，其最大的优势在于简单易行、不需要合成纳米金，解决了纳米金较难制备的问题。同时解决了电化学检测中金活性表面积小的问题。附图说明以下结合附图和具体的实施方式对本专利技术作进一步的说明。图1是本专利技术工艺流程图；图2是本专利技术制备出的柔性银纳米线/纳米金复合电极的SEM图像；图3是柔性银纳米线/纳米金复合电极在硫酸中的电化学性能表征图；图4是本专利技术银纳米线电极、银纳米线/纳米金复合电极阻抗对比结果；图5是本专利技术银纳米线电极、银纳米线/纳米金复合电极循环伏安对比结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但本专利技术不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述实验试剂和材料，均可从商业途径获得。如图1所示，本专利技术工艺流程图。该方法以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为柔性基底，用聚乙烯醇(PVA)与丙三醇(Gly)混合溶液在其表面修饰亲水层，在亲水层上均匀涂布一层银纳米线导电层，并在该导电层上利用电化学沉积的方法沉积纳米金颗粒。制备出新型银纳米线/纳米金电极，将带有巯基的DNA探针固定在纳米金上，构建DNA生物传感器，利用亚甲基蓝(MB)为指示剂快速检测DNA浓度。实施例1使用PVA(2％)与Gly(5％)混合溶液在PDMS表面修饰3次，得到亲水表层，在亲水层上均匀涂布银纳米线导电层，使用KAuCl4(0.01mol/L)和H2SO4(0.5mol/L)混合溶液为电解液，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极，银纳米线导电层为工作电极。采用计时电流法，固定沉积电压为-0.2V，采用400s的沉积时间，进行纳米金沉积。经过电化学沉积，一层金色花状纳米金将沉积在导电层上，制备出银纳米线/纳米金复合电极。将电极浸入含有10-7mol/L的巯基单链DNA(SH-ssDNA)探针的PBS溶液中，避光、室温下反应12h。然后把电极放入空白PBS中，37℃下恒温搅拌1h，以除去非特异性吸附的DNA分子。然后浸入1mMMCH中1h，以进一步消除非特异性吸附DNA分子并获得相对致密的DNA单分子层，后用PBS溶液和二次蒸馏水冲洗干净，氮气干燥备用。将MCH修饰过的DNA探针电极浸入到浓度为10-7靶DNA的PBS溶液中，37℃恒温水浴，搅拌1.5h，得到双链DNA(dsDNA)修饰电极。二次水和PBS溶液反复冲洗，以除去表面吸附的未杂交的靶DNA，氮气干燥，备用。(3)ssDNA或dsDNA修饰电极在1mMMB的PBS(0.1MKCl)溶液中进行循环伏安信号的测定。ssDNA或dsDNA修饰电极置于1mM的亚甲基蓝溶液中浸泡20min，确保亚甲基蓝和DNA链充分静电结合。然后，用二次蒸馏水、PBS(0.1M,pH7.4)溶液反复冲洗以去除电极表面上吸附的分子，记录在除过氧的PBS(0.1M,pH7.4)溶液中的循环伏安信号。CV实验参数是:电位-0.6～0.6V；扫速100mV/s。实施例2使用PVA(2％)与Gly(5％)混合溶液在PDMS表面修饰3次，得到亲水表层，在亲水层上均匀涂布银纳米线导电本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA生物传感器，其特征在于，所述DNA生物传感器是将巯基DNA固定在AuNPs/AgNWs/PDMS电极上；所述AuNPs/AgNWs/PDMS电极的制备方法为：以PDMS为柔性基底，用PVA与Gly混合溶液在其表面修饰亲水表层，在亲水修饰层上均匀涂上一层银纳米线导电层，以KAuCl4和H2SO4混合溶液为电解液，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极，银纳米线导电层为工作电极，采用计时电流法在该导电层上进行电化学沉积金，制备出AuNPs/AgNWs/PDMS电极；所述DNA生物传感器的制备方法为：(1)将所述AuNPs/AgNWs/PDMS电极浸入含有巯基单链DNA探针的PBS溶液中充分反应，然后把电极放入空白PBS中，恒温搅拌，以除去非特异性吸附的DNA分子，然后浸入巯基乙醇中，进一步消除非特异性吸附DNA分子并获得相对致密的DNA单分子层，后用PBS溶液和二次蒸馏水冲洗干净，氮气干燥；(2)将巯基乙醇修饰过的DNA探针电极浸入到不同浓度靶DNA的PBS溶液中，恒温水浴并搅拌，得到双链DNA修饰电极，二次水和PBS溶液反复冲洗，以除去表面吸附的未杂交的靶DNA，氮气干燥，备用。...

【技术特征摘要】
1.一种DNA生物传感器，其特征在于，所述DNA生物传感器是将巯基DNA固定在AuNPs/AgNWs/PDMS电极上；所述AuNPs/AgNWs/PDMS电极的制备方法为：以PDMS为柔性基底，用PVA与Gly混合溶液在其表面修饰亲水表层，在亲水修饰层上均匀涂上一层银纳米线导电层，以KAuCl4和H2SO4混合溶液为电解液，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极，银纳米线导电层为工作电极，采用计时电流法在该导电层上进行电化学沉积金，制备出AuNPs/AgNWs/PDMS电极；所述DNA生物传感器的制备方法为：(1)将所述AuNPs/AgNWs/PDMS电极浸入含有巯基单链DNA探针的PBS溶液中充分反应，然后把电极放入空白PBS中，恒温搅拌，以除去非特异性吸附的DNA分子，然后浸入巯基乙醇中，进一步消除非特异性吸附DNA分子并获得相对致密的DNA单分子层，后用PBS溶液和二次蒸馏水冲洗干净，氮气干燥；(2)将巯基乙醇修饰过的DNA探针电极浸入到不同浓度靶DNA的PBS溶液中，恒温水浴并搅拌，得到双链DNA修饰电极，二次水和PBS溶液反复冲洗，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晶，刘洋，杨丰帆，优雅铃，高婷婷，郎明非，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21