二代测序建库试剂组分质控方法及使用的模板组合技术

本发明专利技术公开了一种对建库流程进行质控的方法，所述方法包括：将A序列末端补平磷酸化加A，A序列为双链序列SEQ ID NO.4，其中最后四个核苷酸GATC为单链末端；将B序列末端补平磷酸化加A，B序列为双链序列SEQ ID NO.8，其中开始四个核苷酸TGCA为单链末端；将C序列末端补平磷酸化加A，C序列为双链序列SEQ ID NO.11。本发明专利技术还公开了对建库过程中的步骤进行质控的模板组合，所述模板组合包括：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ SEQ ID NO.14、ID NO.17、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.23。

【技术实现步骤摘要】
二代测序建库试剂组分质控方法及使用的模板组合
本专利技术属于生物
，涉及二代测序文库构建，更具体来说，是一种二代测序建库试剂组分质控方法及使用的模板组合。
技术介绍
目前基因测序随着成本的降低，二代测序也被广泛使用。对二代测序技术而言，基本可以分为两步分构成，第一步文库的构建，第二步针对已构建的文库进行测序，测序质量的好坏和准确性很大程度上受到文库质量的制约。但是建库过程中使用到的试剂较多，且针对不同的样本建库结果存在明显的区别。特殊样本如FFPE样本，对建库试剂的要求比较高，容易出现建库失败或者建库产出不合格的情况。鉴于其样本的特殊性，建库失败的原因推测有：1)样本差，序列中间存在较多缺刻、修饰等；2)建库人员操作失误，造成部分实验步骤失败；3)建库试剂质量存在问题，导致建库失败；鉴于上述问题我们无法判断问题出现原因。目前针对样本质控有较为全面的阐释，因此较为容易解决样本问题。操作误差可以通过较为细致的实验记录来进行判断，也较为容易进行判断。但是建库试剂由于建库过程中所用试剂较多，无法明确判断是全部试剂失效或者是部分试剂失效，因此针对建库试剂的质控迫在眉睫。目前市面上的建库试剂盒常规建库方法分为：步骤1)对DNA片段进行末端补平以及修复；步骤2)连接适配的接头；步骤3)对加上接头的文库进行扩增。文库质量的成功与否以分别涉及到以上四个步骤；因此对于以上三个步骤每个反应中关键步骤的把控，对于判断建库试剂组分是否合格至关重要。因此本领域需要一种对二代测序建库试剂盒建库试剂主要实验步骤的质控方法。
技术实现思路
为了对建库过程中各个步骤进行质控，专利技术人选择了几种同一来源的不同片段作为质控步骤的模板，分别对建库流程中各步骤进行质控，来判断建库试剂是否合格以及出现质量问题的试剂组分。因此，在第一方面，本专利技术提供了一种对建库流程进行质控的方法，所述方法包括：将A序列末端补平磷酸化加A，A序列为双链序列SEQIDNO.4，其中最后四个核苷酸GATC为单链末端；将B序列末端补平磷酸化加A，B序列为双链序列SEQIDNO.8，其中开始四个核苷酸TGCA为单链末端；将C序列末端补平磷酸化加A，C序列为双链序列SEQIDNO.11。在一个实施方案中，所述方法还包括：将D序列末端补平磷酸化加A，D序列为双链序列SEQIDNO.14；将E序列与接头连接，E序列为双链序列SEQIDNO.17；将F序列进行PCR扩增，F序列为双链序列SEQIDNO.20；将G序列进行文库片段纯化，G序列为双链序列SEQIDNO.23。在一个实施方案中，所述方法还包括制备序列A和序列B的步骤：使用引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2扩增SEQIDNO.24，然后用限制性内切酶BamHI-HF进行切割；使用引物对SEQIDNO.5和SEQIDNO.6扩增SEQIDNO.24，然后用限制性内切酶BamHI-HF进行切割。在一个实施方案中，所述方法还包括制备序列D-G的步骤：使用引物对SEQIDNO.9和SEQIDNO.10；SEQIDNO.12和SEQIDNO.13；SEQIDNO.15和SEQIDNO.16；SEQIDNO.18和SEQIDNO.19；SEQIDNO.21和SEQIDNO.22扩增SEQIDNO.24。在第二方面，本专利技术还提供了一种对建库过程中的步骤进行质控的模板组合，所述模板组合包括：SEQIDNO.4、SEQIDNO.8、SEQIDNO.11、SEQSEQIDNO.14、IDNO.17、SEQIDNO.20和SEQIDNO.23。在第三方面，本专利技术还提供了用于制备本专利技术第二方面的模板组合的引物组，所述引物组包括选自如下的引物对：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；SEQIDNO.9和SEQIDNO.10；SEQIDNO.12和SEQIDNO.13；SEQIDNO.15和SEQIDNO.16；SEQIDNO.18和SEQIDNO.19；SEQIDNO.21和SEQIDNO.22。利用本专利技术的模板组合、引物组、方法，可以实现对二代测序建库试剂盒建库试剂主要实验步骤的质控。附图说明通过以下附图对本专利技术进行说明图1是设计质控模板片段在SEQIDNO.24载体上的分布。图2是从SEQIDNO.24载体制备A片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。图3是从SEQIDNO.24载体制备B片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。图4是从SEQIDNO.24载体制备C片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。图5是从SEQIDNO.24载体制备D片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。图6是从SEQIDNO.24载体制备E片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。图7是从SEQIDNO.24载体制备F片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。图8是从SEQIDNO.24载体制备G片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。图9是在质控过程中A片段比对结果。图10是在质控过程中B片段比对结果。图11是在质控过程中C片段比对结果。图12是在质控过程中D片段比对结果。图13是在质控过程中E片段上机测序以及结果判定。图14是在质控过程中F片段上机测序以及结果判定。图15是在质控过程中G和F片段上机测序以及结果判定。具体实施方式实验步骤实例如下：为了对建库过程中各个步骤进行质控，专利技术人选择了几种同一来源的不同片段作为质控步骤的模板，分别对建库流程中各步骤进行质控，来判断建库试剂是否合格以及出现质量问题的试剂组分。具体操作方法如下：步骤一：获得末端修复、磷酸化、加A、接头连接、PCR扩增，每步的质控模板；使用SEQIDNO.24载体为模板，使用不同的引物、酶进行扩增得到不同作用的质控片段。设计质控模板片段分布如图1所示。片段对应的目的以及质控步骤列表如下：一)制备5’端突出的模板片段(A片段)；1)使用SEQIDNO.24载体为模板，使用引物对A-F/R(A-F:TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCAC(SEQIDNO.1)；A-R：TTTTCCCAGTCACGACGTTGT(SEQIDNO.2))，在KAPA高保真聚合酶的作用下得到片段大小约为215bp的平末端片段。具体序列如下(下划线部分表示酶切位点)：>5'-3’TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAA(SEQIDNO.3)。实验步骤如下：①按照下表配制PCR扩增体系配制：试剂体积SEQIDNO.24(质粒)5ng/ul1μl5×HiFibuffer10μl10mMdNTP1.5μlKAPA高保真聚合酶1μlA-F/R引物(10uM)2.5μl无核酸酶污染的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对建库流程进行质控的方法，所述方法包括：将A序列末端补平磷酸化加A，A序列为双链序列SEQ ID NO.4，其中最后四个核苷酸GATC为单链末端；将B序列末端补平磷酸化加A，B序列为双链序列SEQ ID NO.8，其中开始四个核苷酸TGCA为单链末端；将C序列末端补平磷酸化加A，C序列为双链序列SEQ ID NO.11。

【技术特征摘要】
1.一种对建库流程进行质控的方法，所述方法包括：将A序列末端补平磷酸化加A，A序列为双链序列SEQIDNO.4，其中最后四个核苷酸GATC为单链末端；将B序列末端补平磷酸化加A，B序列为双链序列SEQIDNO.8，其中开始四个核苷酸TGCA为单链末端；将C序列末端补平磷酸化加A，C序列为双链序列SEQIDNO.11。2.权利要求1的质控方法，所述方法还包括：将D序列末端补平磷酸化加A，D序列为双链序列SEQIDNO.14；将E序列与接头连接，E序列为双链序列SEQIDNO.17；将F序列进行PCR扩增，F序列为双链序列SEQIDNO.20；将G序列进行文库片段纯化，G序列为双链序列SEQIDNO.23。3.权利要求1的方法，所述方法还包括制备序列A和序列B的步骤：使用引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2扩增SEQIDNO.24，然后用限制性内切酶BamHI-HF进行切割；使用引物对SEQIDNO.5和SEQIDNO.6扩增SEQIDNO.24，然后用限制性内切酶BamHI-HF进行切割...

【专利技术属性】
技术研发人员：任丽平，王瑞超，梁加龙，蔡万世，
申请(专利权)人：艾吉泰康生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11