一种提高白藜芦醇累积量的生物方法技术

本发明专利技术公开了一种含有白藜芦醇合成酶系与丙二酰辅酶A合成酶的基因缺陷型大肠杆菌菌株及其构建方法、提高白藜芦醇含量的方法。本发明专利技术提供的白藜芦醇合成酶系与丙二酰辅酶A合成酶构成的重组质粒包括Rgtal，Pc4cl，Ahsts，accBC，PTDH序列和两段合适的载体片段。本发明专利技术提供的提高白藜芦醇累积量的生物方法为，将白藜芦醇合成酶系与丙二酰辅酶A合成酶构成的重组质粒，即pCDF‑Rgtal‑Pc4cl‑Ahsts和pACYC‑accBC‑PTDH转化到延胡索酸酶基因缺陷的大肠杆菌菌株ΔfumB，获得工程菌并发酵，经过培养基优化后的白藜芦醇产量可达22.62mg/L，较原始菌株提高了5.73倍。

【技术实现步骤摘要】
一种提高白藜芦醇累积量的生物方法
本专利技术属于生物工程
，具体地说，是关于一株白藜芦醇合成酶系与延胡索酸基因B缺陷型菌株高产白藜芦醇的方法。
技术介绍
白藜芦醇(Resveratrol，Res)是一类含有芪类结构的多酚类化合物，又被称为芪三酚，其化学分子式为C14H12O3，无色针状结晶，易溶于乙醚、甲醇、乙醇等有机溶剂中，于1940年首次从毛叶藜芦的根部提取得到。在于很多自然界的植物中，如葡萄、虎杖、花生、桑植等植物当中都存在白藜芦醇，是植物为了保护自身防止被病菌侵害而产生的抗毒物质。白藜芦醇具有预防和治疗动脉粥样硬化，降低血小板聚集，抗病毒等多种生理活性，已被美国，加拿大等国家列为保健品，在中国，白藜芦醇提取物被制成了具有调血脂、抗肿瘤作用的胶囊。目前白藜芦醇的生产方法主要有溶剂提取法、酶法提取、超临界CO2萃取、微波萃取、生物发酵法提取等，作为一种近年来出现的方法，生物发酵法具有低耗能，低成本，生产速率快，反应条件温和等优势，而逐渐成为了生产白藜芦醇的主要趋势，但由于白藜芦醇合成酶的酶活较低，生物合成过程中辅因子的缺乏，成为了白藜芦醇高产的限制因素。近来分子生物学的发展也为研究者从分子水平探究、提高白藜芦醇产量提供了新思路，白藜芦醇合成有三个关键酶基因，分别是酪氨酸裂解酶(TAL)、香豆酰连接酶(4CL)和白藜芦醇合成酶(STS)，三种基因以酪氨酸为底物合成白藜芦醇。丙二酰CoA是白藜芦醇生物合成的主要底物之一，但是由于丙二酰CoA在生物体内合成效率不高成为了提高白藜芦醇产量的主要限制因素，因此通过分子生物学方法通过向细胞内导入表达丙二酰CoA合成酶的质粒，从而使胞内白藜芦醇产量得以提高，其次可以通过增加ATP的合成，使白藜芦醇合成中的关键酶基因4CL的底物转化效率得到提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供了白藜芦醇合成通路上的三个关键酶基因及构建重组质粒的方法。本专利技术还有一个目的在于，提供一种乙酰CoA脱羧酶(accBC)及构建重组质粒的方法，其能促进丙二酰CoA合成。本专利技术还有一个目的在于，提供一种亚磷酸盐脱氢酶基因(PTDH)及构建重组质粒的方法，其能间接促进ATP合成。本专利技术还有一个目的在于，提供一种白藜芦醇合成酶系和accBC、PTDH组合生产白藜芦醇的菌株。本专利技术还有一个目的在于，提供一种敲除延胡索酸酶基因(fumB)的方法，用以抑制丙二酰CoA在旁路途径中被消耗。本专利技术提供的白藜芦醇合成酶系重组质粒包括Rgtal，Pc4cl和Ahsts基因序列和一个合适的载体片段；根据本专利技术的一个优选实例，在白藜芦醇三种基因构成的重组质粒中，Rgtal，Pc4cl和Ahsts编码区置于T7启动子之后。根据本专利技术的另一个优选实施例，所述白藜芦醇三种基因构成的重组质粒具有壮观霉素抗性基因，用以筛选基因重组菌。根据本专利技术的一个优选实例，所述accBC和PTDH构建在同一蛋白表达质粒中，accBC及PTDH编码区置于T7启动子之后。根据本专利技术的一个优选实例，所述accBC和PTDH基因构成的重组质粒具有氯霉素抗性基因，用以筛选基因重组菌。本专利技术提供的白藜芦醇合成酶系构成的重组质粒的构建方法包括以下步骤：A)PCR扩增获得Rgtal，Pc4cl和Ahsts序列；B)利用overlapPCR将Pc4cl和Ahsts序列连接在一起；C)将Rgtal片段克隆到pCDF-duet的第一个多克隆位点，将Pc4cl和Ahsts克隆到pCDF-duet的第二个多克隆位点。本专利技术提供的accBC和PTDH构成的重组质粒的构建方法包括以下步骤：A)PCR扩增获得accBC、PTDH序列；B)将accBC片段克隆到pACYC-duet的第一个多克隆位点，将PTDH克隆到pACYC-duet的第二个多克隆位点。本专利技术提供的fumB基因缺陷型菌株的敲除方法包括以下步骤：A)利用PCR技术从pKD4质粒中扩增获得卡那霉素(kana)序列；B)将kana基因电转入大肠杆菌BL21(DE3)中，用以置换fumB基因；C)消除kana基因以实现fumB基因的敲除；本专利技术提供的白藜芦醇合成酶系重组质粒与accBC、PTDH基因构成的重组质粒可用于构建表达白藜芦醇合成酶系与丙二酰CoA合成酶的基因缺陷型菌株。本专利技术提供的累积白藜芦醇的方法通过发酵培养本专利技术提供的表达白藜芦醇合成酶系与表达丙二酰CoA合成酶的fumB基因缺陷型菌株，累积白藜芦醇。根据本专利技术的另一个优选实施例，通过对所专利技术的表达白藜芦醇的基因缺陷型菌株进行发酵，对发酵的温度、诱导剂IPTG的浓度、诱导剂IPTG的添加时间、酪氨酸添加时间、反应时间进行摸索，获得最优的发酵条件。使用本专利技术提供的合成白藜芦醇的基因缺陷型菌株，可以显著地提高白藜芦醇生产量，由原始菌株的3.95mg/L提高到优化后的22.62mg/L，为进一步研究白藜芦醇产量建立一种方法，为其产业化生产奠定一种基础。附图说明图1是pCDF-Rgtal-Pc4cl-Ahsts的质粒图谱示意图，Rgtal，Pc4cl和Ahsts均位于T7强启动子之后。图2是pACYC-accBC-PTDH质粒图谱示意图，accBC、PTDH位于T7强启动子下。图3是PCR扩增获Rgtal的检测结果，其中泳道1为RgtalPCR扩增产物，M是蛋白标准分子量。图4是overlapPCR扩增获Pc4C1-Ahsts的检测结果，其中泳道1为获Pc4C1-Ahsts扩增产物，M是蛋白标准分子量。图5是PCR扩增获accBC的检测结果，其中泳道1为accBCPCR扩增产物，M是蛋白标准分子量。图6是PCR扩增获PTDH的检测结果，其中泳道1为PTDHPCR扩增产物，M是蛋白标准分子量。图7是的fumB基因敲除PCR鉴定结果，其中泳道1为ΔfumB的PCR扩增产物，泳道2为fumB的PCR扩增产物，M是蛋白标准分子量。图8是pCDF-ΔfumB-Res蛋白表达的SDS-PAGE结果，其中1泳道为pCDF-ΔfumB-Res纯化后的蛋白，2泳道为未加诱导剂的阴性对照，3泳道为pCDF-ΔfumB-Res超声后的粗蛋白，M是蛋白标准分子量。图9是白藜芦醇液相结果图，A是白藜芦醇的阳性对照，B为工程菌表达白藜芦醇的结果。图10是pCDF-ΔfumB-Res，pCDF-Res，pCDF-fumB-Res工程菌不同诱导条件下白藜芦醇产量结果。图11是pCDF-ΔfumB-Res菌株在不同碳源下白藜芦醇产量结果。图12是pCDF-ΔfumB-Res菌株在不同氮源下白藜芦醇产量结果。图13是pCDF-ΔfumB-Res菌株在不同微量离子下白藜芦醇产量结果。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork：CoLdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件或厂商提供的方案进行。在本专利技术的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、均购自生工生物公司。在本专利技术的下述实施例中，使用的ClonExpressII和Turbo保真酶来自南京诺唯赞生物科技有限本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株能合成白藜芦醇的大肠杆菌菌株，其特征在于，包括pCDF‑Rgtal‑Pc4cl‑Ahsts重组质粒和pACYC‑accBC‑PTDH重组质粒。Rgtal，Pc4cl和Ahsts基因用于合成白藜芦醇，accBC用于提高丙二酰CoA含量，PTDH用于提高ATP含量，载体片段分别为pCDFDuet‑1和pACYC Duet‑1。

【技术特征摘要】
1.一株能合成白藜芦醇的大肠杆菌菌株，其特征在于，包括pCDF-Rgtal-Pc4cl-Ahsts重组质粒和pACYC-accBC-PTDH重组质粒。Rgtal，Pc4cl和Ahsts基因用于合成白藜芦醇，accBC用于提高丙二酰CoA含量，PTDH用于提高ATP含量，载体片段分别为pCDFDuet-1和pACYCDuet-1。2.如权利要求1所述的共表达重组质粒，其特征在于，所述Rgtal和accBC基因分别位于pCDFDuet-1和pACYCDuet-1的第一个多克隆位点，Pc4cl，Ahsts和PTDH基因分别位于pCDFDuet-1和pACYCDuet-1的第二个多克隆位点。3.权利要求1-2中任一项所述的共表达重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：A)PCR扩增获得Rgtal，Pc4cl，Ahsts，accBC，PTDH基因序列；B)将Rgtal，...

【专利技术属性】
技术研发人员：许激扬，卞筱泓，王郑隆，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32