芽孢杆菌H3、由其发酵鱼皮制备胶原蛋白多肽的用途和胶原蛋白多肽制造技术

本发明专利技术提供芽孢杆菌H3、由其发酵鱼皮制备胶原蛋白多肽的用途和胶原蛋白多肽，所述芽孢杆菌H3的保藏号为CGMCCNO：15830，可以从土壤中分离得到；利用芽孢杆菌H3制备种子液，鱼皮粉碎制备发酵培养基，依次经接菌发酵、发酵液离心、旋转蒸发浓缩和真空冷冻干燥，制得胶原蛋白多肽；所得胶原蛋白多肽保留完整的三螺旋结构，同时具有良好的溶解性、乳化性和稳定性。与现有胶原蛋白多肽的制备方法相比，工艺简单，操作方便，且不需使用大量化学试剂，有利于环境保护，提取的胶原蛋白多肽分子量更小，易吸收，可用于食品、化妆品和保健品领域。

Application of Bacillus H3, Collagen Peptide Prepared from Fish Skin Fermented by Bacillus H3 and Collagen Peptide

The invention provides the use of Bacillus H3, the preparation of collagen protein polypeptide from its fermented fish skin, and the collagen protein polypeptide. The storage number of Bacillus H3 is CGMCCNO:15830, which can be separated from soil. The seed liquid is prepared by Bacillus H3, and the fish skin is crushed to prepare fermentation medium, which is successively fermented by inoculation, centrifugation of fermentation liquid, rotary evaporation concentration and vacuum freeze-drying. The obtained collagen polypeptide retains the complete triple helix structure and has good solubility, emulsification and stability. Compared with the existing preparation methods of collagen polypeptide, the process is simple, easy to operate, and does not need to use a large number of chemical reagents, which is conducive to environmental protection. The extracted collagen polypeptide has smaller molecular weight and is easy to absorb, and can be used in the field of food, cosmetics and health care products.

【技术实现步骤摘要】
芽孢杆菌H3、由其发酵鱼皮制备胶原蛋白多肽的用途和胶原蛋白多肽
本专利技术属于胶原蛋白多肽制备
，具体涉及一种微生物菌株芽孢杆菌H3，以及由该菌株发酵鱼皮制备胶原蛋白多肽的用途，还涉及胶原蛋白多肽及其制备方法。
技术介绍
胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质，是细胞外基质的主要成分，也是是动物结缔组织中的主要成分，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白。胶原蛋白的来源和营养十分丰富，其结构和功能特性具有多样性和复杂性，在生物制药、医疗保健、美容化妆、组织工程、食品工业等领域都能发挥功效，具有良好应用前景。然而，由于其分子量很大，不利于肠胃和皮肤的吸收，限制了其生物活性。与胶原蛋白相比，胶原蛋白多肽不仅有胶原蛋白的营养特性，而且具有易于消化吸收、低过敏性、食用安全等优点。此外，胶原蛋白多肽还具有抗氧化、降血压、提高免疫力、改善记忆力和抗肿瘤等生物活性。现有的胶原蛋白肽生产方法中脱脂、去腥、脱色等工序单独进行，工艺较为复杂、成本高，且所用的纯酶制剂价格昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种由微生物发酵鱼皮制备胶原蛋白多肽的方法，解决现有的胶原蛋白肽生产方法中脱脂、去腥、脱色等工序单独进行时工艺较为复杂、所用纯酶制剂价格昂贵导致成本较高的问题。本专利技术的另一目的在于提供一种产生胶原蛋白酶的菌株芽孢杆菌(Bacillus)H3，由该芽孢杆菌H3制得胶原蛋白酶，并经微生物发酵鱼皮制备上述胶原蛋白多肽。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术的第一方面，芽孢杆菌H3，其保藏号为CGMCCNO：15830。进一步地，所述芽孢杆菌H3可土壤中分离筛选得到，其16SrDNA序列如SEQIDNO：1所示。进一步地，所述芽孢杆菌H3的分离筛选方法为：(1)制备富集培养液：称取土样1g，在无菌条件下接入含有50mL富集培养基的三角瓶中，160～180r/min、37℃摇瓶培养3天，富集培养三次，得富集培养液；其中，所述富集培养基由质量体积比为1:10(w:v)的鱼皮和蒸馏水组成；(2)稀释涂布：将步骤(1)制备的富集培养液梯度稀释后涂布于初筛平板上，37℃培养箱中培养24h，观察菌落生长情况；(3)分离纯化：从步骤(2)的菌株中挑选单菌落，进行平板划线，37℃培养箱培养；(4)明胶液化：对步骤(3)的单菌落进行明胶穿刺，37℃培养箱培养，并取上清测定酶活后确定胶原蛋白酶活力高的菌株，即得。进一步地，所述芽孢杆菌H3的鉴定方法为：将上述分离得到的菌株H3于37℃在营养琼脂培养基中划线培养生长，菌落圆形，表面湿润、不透明、边缘不整齐，为白色或微黄色；挑取其中单菌落进行革兰氏染色后呈紫色、短杆状，说明菌株H3为革兰氏阳性菌；再以菌株H3总DNA为模板，采用16SrDNA通用引物进行PCR扩增，检测得到一条清晰条带，测序得到16SrDNA序列如SEQIDNO：1所示，去掉杂峰区序列后的1446bp，在NCBI上同源性比较，Bacilluscereus.HYM88的同源性为99％，说明菌株H3属于芽孢杆菌。本专利技术的第二方面，上述芽孢杆菌H3在制备胶原蛋白多肽的用途，通过所述芽孢杆菌H3发酵鱼皮制得。进一步地，通过所述芽孢杆菌H3接种于由鱼皮制备的发酵培养基制得。更进一步地，所述芽孢杆菌H3发酵鱼皮制备胶原蛋白多肽的方法包括：(ⅰ)将干鱼皮剪成0.5cm×0.5cm的若干小块，粉碎后所得碎鱼皮121℃灭菌20min，或与蒸馏水以质量体积比为1～5：50混合后121℃灭菌20min，得发酵培养基；(ⅱ)将权利要求1～4任一项所述芽孢杆菌H3接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基37℃培养24h进行活化，活化后的菌种接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37℃、160～180r/min摇床培养24～28h，制得种子液；其中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为3g牛肉膏、10g蛋白胨和5gNaCl溶于1000mL蒸馏水而得，pH7.2～7.4；(ⅲ)将步骤(ⅱ)所得种子液接种于步骤(ⅰ)中的发酵培养基中，所述芽孢杆菌H3的接种量为4％～10％，于25℃～40℃、160～180r/min进行发酵培养28h～56h，制得发酵液；(ⅳ)将步骤(ⅲ)所得发酵液4000r/min离心30min，取上清液，去除杂质，进行真空冷冻干燥48h，得到胶原蛋白多肽。更进一步地，当步骤(ⅰ)中所述发酵培养基为粉碎后所得碎鱼皮121℃灭菌20min时，步骤(ⅲ)中发酵温度为25℃～30℃，发酵时间为28h～36h；当步骤(ⅰ)中所述发酵培养基为粉碎后所得碎鱼皮与蒸馏水以质量体积比为1～5：50混合后121℃灭菌20min时，步骤(ⅲ)中发酵温度为30℃～40℃，发酵时间为36h～56h。本专利技术的第三方面，胶原蛋白多肽，其分子量为45kDa～60kDa，且具有完整三螺旋结构；其可通过上述芽孢杆菌H3发酵鱼皮制得。进一步地，所述胶原蛋白多肽的制备方法包括：(ⅰ)将干鱼皮剪成0.5cm×0.5cm的若干小块，粉碎后所得碎鱼皮121℃灭菌20min，或与蒸馏水以质量体积比为1～5：50混合后121℃灭菌20min，得发酵培养基；(ⅱ)将权利要求1～4任一项所述芽孢杆菌H3接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基37℃培养24h进行活化，活化后的菌种接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37℃、160～180r/min摇床培养24～28h，制得种子液；其中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为3g牛肉膏、10g蛋白胨和5gNaCl溶于1000mL蒸馏水而得，pH7.2～7.4；(ⅲ)将步骤(ⅱ)所得种子液接种于步骤(ⅰ)中的发酵培养基中，所述芽孢杆菌H3的接种量为4％～10％，于25℃～40℃、160～180r/min进行发酵培养28h～56h，制得发酵液；(ⅳ)将步骤(ⅲ)所得发酵液4000r/min离心30min，取上清液，去除杂质，进行真空冷冻干燥48h，得到胶原蛋白多肽。更进一步地，当步骤(ⅰ)中所述发酵培养基为粉碎后所得碎鱼皮121℃灭菌20min时，步骤(ⅲ)中发酵温度为25℃～30℃，发酵时间为28h～36h；当步骤(ⅰ)中所述发酵培养基为粉碎后所得碎鱼皮与蒸馏水以质量体积比为1～5：50混合后121℃灭菌20min时，步骤(ⅲ)中发酵温度为30℃～40℃，发酵时间为36h～56h。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术的芽孢杆菌H3是非致病菌，对营养要求低，发酵条件易操作，产酶量高；且该菌株所产胶原蛋白酶对胶原蛋白的水解效率高，对鱼皮等大分子的胶原蛋白具有较好的水解作用，利用该菌株对鱼皮进行发酵并用于制备胶原蛋白多肽，无需经过常规提取方法中脱脂、去腥、脱色等工序，工艺简单，操作方便，不需使用大量化学试剂，有利于环境保护，避免设备长期遭受酸腐蚀，减少生产成本。附图说明本专利技术中芽孢杆菌H3，于2018年05月31日在位于北京市朝阳区北辰西路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNO：15830。图1为不同接种量对胶原蛋白多肽提取率的影响。图2为不同温度对胶原蛋白多肽提取率的影响。图3为不同时间对胶原蛋白多肽提取率的影响。图4为本专利技术微生物发酵提取胶原蛋白多肽的红外光谱图。图5为市售胶原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.芽孢杆菌H3，其保藏号为CGMCCNO：15830。

【技术特征摘要】
1.芽孢杆菌H3，其保藏号为CGMCCNO：15830。2.如权利要求1所述的芽孢杆菌H3，其特征在于，可土壤中分离筛选得到，其16SrDNA序列如SEQIDNO：1所示。3.如权利要求1或2所述的芽孢杆菌H3，其特征在于，所述芽孢杆菌H3的分离筛选方法为：(1)制备富集培养液：称取土样1g，在无菌条件下接入含有50mL富集培养基的三角瓶中，160～180r/min、37℃摇瓶培养3天，富集培养三次，得富集培养液；其中，所述富集培养基由质量体积比为1:10(w:v)的鱼皮和蒸馏水组成；(2)稀释涂布：将步骤(1)制备的富集培养液梯度稀释后涂布于初筛平板上，37℃培养箱中培养24h，观察菌落生长情况；(3)分离纯化：从步骤(2)的菌株中挑选单菌落，进行平板划线，37℃培养箱培养；(4)明胶液化：对步骤(3)的单菌落进行明胶穿刺，37℃培养箱培养，并取上清测定酶活后确定胶原蛋白酶活力高的菌株H3，即得。4.如权利要求3所述的芽孢杆菌H3，其特征在于，所述菌株H3的鉴定方法为：将上述分离得到的菌株H3于37℃在营养琼脂培养基中划线培养生长，菌落圆形，表面湿润、不透明、边缘不整齐，为白色或微黄色；挑取其中单菌落进行革兰氏染色后呈紫色、短杆状，说明菌株H3为革兰氏阳性菌；再以菌株H3总DNA为模板，采用16SrDNA通用引物进行PCR扩增，检测得到一条清晰条带，测序得到16SrDNA序列如SEQIDNO：1所示，去掉杂峰区序列后的1446bp，在NCBI上同源性比较，Bacilluscereus.HYM88的同源性为99％，说明菌株H3属于芽孢杆菌。5.权利要求1～4任一项所述芽孢杆菌H3在制备胶原蛋白多肽的用途，其特征在于，通过所述芽孢杆菌H3发酵鱼皮制得。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，通过所述芽孢杆菌H3接种于由鱼皮制备的发酵培养基制得。7.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述芽孢杆菌H3发酵鱼皮制备胶原蛋白多肽的方法包括：(ⅰ)将干鱼皮剪成0.5cm×0.5cm的若干小块，粉碎后所得碎鱼皮121℃灭菌20min，或与蒸馏水以质量体积比为1～5：50混合后121℃灭菌20min，得发酵培养基；(ⅱ)将权利要求1～4任一项所述芽孢杆菌H3接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基37℃培养24h进行活化，活化后的菌种接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37℃、160～180r/min摇床培养24～28h，制得种子液；其中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为3g...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓晖，韩玮，刑瀚文，施文正，钟建，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31