一种鉴定胸腔积液生物标记物的方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了用于鉴定胸腔积液的生物标记物及其应用。所述生物标记物为患者血清经过柱前1‑苯基‑5‑甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱(HPLC)得到的游离葡萄糖和甘露糖。本发明专利技术的技术方案具有前处理简单，分析时间短，仪器价格合理，符合常规使用，操作步骤简单易学，检测结果准确性高，只需采血进行HPLC仪分析便可区分正常人和患者，并且所需血清量极少，采血量小于1mL等优点。所得结果显示此分析方法可以快速分析血清中游离的甘露糖和葡萄糖，并可以计算得到甘露糖、葡萄糖糖浓度及二者峰面积，对于研究血清游离甘露糖和葡萄糖与疾病之间的关系、寻找新型胸腔积液疾病临床检测的标志物有着非常重要的意义。

A Method for Identification of Biomarkers in Pleural Effusion and Its Detection Kit

The invention provides a biomarker for identifying pleural effusion and its application. The biomarker is free glucose and mannose obtained by high performance liquid chromatography (HPLC) derived from patient serum by pre-column 1 phenyl 5 methyl pyrazolone (PMP). The technical scheme of the present invention has the advantages of simple pretreatment, short analysis time, reasonable instrument price, conforming to routine use, simple operation steps and easy learning, high accuracy of detection results, distinguishing normal people from patients only by taking blood for analysis by high performance liquid chromatography, and requires very little serum and less than 1 mL of blood. The results show that this method can rapidly analyze free mannose and glucose in serum, and calculate the concentration and peak area of mannose and glucose. It is very important to study the relationship between serum free mannose and glucose and diseases, and to find new markers for clinical detection of pleural effusion diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定胸腔积液生物标记物的方法及其检测试剂盒
本专利技术属于医药
，具体涉及用于鉴定胸腔积液的生物标记物及其检测应用。
技术介绍
胸腔积液(pleuraleffusion)是以胸膜腔内病理性液体积聚为特征的一种常见临床症候。这种多余的液体可以通过限制肺的扩张来损害呼吸。各种胸腔积液，取决于液体的性质和导致其进入胸膜腔的原因，是胸腔积液(浆液)，血胸(血液)，尿胸(尿液)，乳糜胸(乳糜)或脓胸(脓)。胸膜毛细血管内静水压增高(如充血性心力衰竭)、胸膜通透性增加(如胸膜炎症、肿瘤)、胸膜毛细血管内胶体渗透压降低(如低蛋白血症、肝硬化)，壁层胸膜淋巴回流障碍(如癌性淋巴管阻塞)以及胸部损伤等，均可引起胸腔积液。胸腔积液的鉴别诊断一直都是临床工作中的难题，早在1997年PET/CT就被报道可用于诊断MPE，但由于敏感度和特异度都差强人意，迄今未获推荐应用于实际的临床工作。胸腔镜对于诊断恶性胸腔积液的价值早已得到呼吸科和肿瘤科大夫的广泛认同，再结合应用荧光技术可探查微小的胸膜病变并准确地辨认病变范围，大大提高诊断的敏感度及阴性预计值。诊断恶性胸腔积液的金标准是在胸水或胸膜活检组织中找到恶性细胞，难题在于并非所有的恶性胸腔积液都能找到恶性细胞。因此，科学家们希望能找到无创的来提高诊断效率。如何精确识别胸腔积液的易感人群以便早期干预，或能否筛选合适的生物标志物以预测疾病治疗的效果或者预测疾病的进展等已成为热点问题。人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常体检人群的范围为3.90～6.16mmol/L。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为20～80μmol/L。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。D-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中N-糖链的重要组分，N-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。目前没有文献报道柱前1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱法同时检测胸腔积液患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖。因此，建立高效准确的血清中游离甘露糖的检测方法，对于研究血清游离单糖与疾病之间的关系、寻找疾病临床检测的标志物有着非常重要的意义。单糖的PMP衍生法是目前较为常用的单糖检测方法。该方法包括以下几个步骤：(1)为PMP创建碱性条件，(2)加入PMP，在70℃进行衍生，(3)调节衍生后的溶液pH，将残余PMP萃取出来。专利技术专利CN103969371B公开了“一种血液降解得到并检测单糖的方法在癌症检测中的应用”。该专利技术专利首先将血清样品通过酸降解，将其中的多糖和糖蛋白降解为单糖组分；然后经过PMP衍生和高效液相对降解后得到的8种单糖进行检测。相比降解前的血清，样品组分与性质已经发生巨大变化。虽然单糖的PMP衍方法在各个领域应用比较广泛，但目前尚无报道将该方法应用于胸腔积液患者的血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了用于鉴定胸腔积液的生物标记物及其应用，本专利技术采用柱前PMP衍生的高效液相色谱法(HPLC)检测胸腔积液患者血清中的单糖，尤其涉及血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。本专利技术的技术方案可以用于检测胸腔积液患者或正常体检人群血清游离葡萄糖和甘露糖浓度并对二者峰面积计算比值，可以用于鉴定胸腔积液患者。为实现本专利技术的目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：用于鉴定胸腔积液的生物标记物，所述生物标记物为患者血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。用于鉴定胸腔积液的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：该方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：(1)调节pH为7-14：取待检测的血清样品加超纯水于EP管中，加入氢氧化钠，涡旋混匀；(2)PMP衍生：每个样品加入PMP，涡旋混匀，离心后置于烘箱反应；(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入盐酸，涡旋混匀；(4)萃取：每管加入有机溶剂，涡旋，离心，移除下层有机溶剂，保留上清；(5)将样品离心，取上清液于装有内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析；(6)制备甘露糖和葡萄糖的标准曲线；(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(6)中的标准曲线比对并分析计算，确定甘露糖、葡萄糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖浓度的比值。所述高效液相色谱为Agilent1260高效液相系统，AgilentPoroshellEC-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)，所述步骤(5)中的色谱条件为：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1mL/min；进样体积：20μL；流动相：A相为乙腈，B相为pH为5.5的0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液。所述步骤(5)中流动相的梯度变化为：0min，A相15％，B相85％；10min，A相22％，B相78％；15min，A相24％，B相76％；15.1min，A相15％，B相85％；20min，A相15％，B相85％。所述步骤(3)中盐酸的浓度为0.3mol/L。所述步骤(4)中有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种。生物标记物在制备用于检测胸腔积液的试剂盒中的用途。生物标记物在制备用于检测胸腔积液的试剂盒中的用途，其特征在于：所述试剂盒中包括浓度为82.42μmol/L甘露糖和浓度为4474μmol/L葡萄糖的标准液。一种鉴定胸腔积液的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有生物标记物，即血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。所述试剂盒中包括浓度浓度为82.42μmol/L甘露糖和浓度为4474μmol/L葡萄糖的标准液。鉴定胸腔积液的试剂盒在制备用于检测胸腔积液的试剂盒中的用途。与现有技术相比，本专利技术将柱前PMP衍生的高效液相色谱法用于胸腔积液患者血清游离单糖的检测，其有益技术效果是：1、前处理简单。2、分析时间短。3、所需要的血清用量少，每次只需小于1mL的血量。4、仪器价格合理，符合常规使用。5、操作步骤简单易学。6、检测准确。本专利技术采用柱前PMP衍生的高效液相色谱法同时测定血清游离甘露糖和葡萄糖，简化操作，并且血清用量少，而且也已证实此方法甘露糖浓度的测定不会受高浓度葡萄糖的影响。通过对血清游离葡萄糖、甘露糖浓度，及葡萄糖和甘露糖峰面积的比值(G/M比值)的统计学数据分析，建立了与胸腔积液的关系。使用本专利技术的技术方案，通过检测血清中游离的甘露糖和葡萄糖，计算甘露糖和葡萄糖浓度，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴定胸腔积液的生物标记物，其特征在于：所述生物标记物为血清经过柱前1‑苯基‑5‑甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱(HPLC)得到的游离葡萄糖和甘露糖。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定胸腔积液的生物标记物，其特征在于：所述生物标记物为血清经过柱前1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱(HPLC)得到的游离葡萄糖和甘露糖。2.根据权利要求1所述的用于鉴定胸腔积液的生物标记物，其特征在于：该方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：(1)调节pH为7-14：取待检测的血清样品加超纯水于EP管中，加入氢氧化钠，涡旋混匀；(2)PMP衍生：每个样品加入PMP，涡旋混匀，离心后置于烘箱反应；(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入盐酸，涡旋混匀；(4)萃取：每管加入有机溶剂，涡旋，离心，移除下层有机溶剂，保留上清；(5)将样品离心，取上清液于装有内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析；(6)制备葡萄糖和甘露糖的标准曲线；(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(6)中的标准曲线比对并分析计算，确定葡萄糖、甘露糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖峰面积的比值。3.根据权利要求1所述的用于鉴定胸腔积液的生物标记物，其特征在于：所述高效液相色谱为Agilent1260高效液相系统，AgilentPoroshellEC-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)，所述步骤(5)中的色谱条件为：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1mL/min；进样体积：20μL；流动相：A相为乙腈，B相为pH为5.5的0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液。4.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽娟，郝翠，陆海军，张清华，
申请(专利权)人：青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：山东,37