本发明专利技术公开了一种柱前衍生化HPLC‑MS/MS检测桂花中单糖组分的方法。本发明专利技术以1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化为前处理手段，采用高效液相色谱与电喷雾电离质谱联用对桂花中的6种单糖成分进行同时测定，方法简单、灵敏、选择性高、分离效率高、进样量少、分析时间短、多模式测定等优点，为桂花中多糖的单糖成分研究提供科学依据。该方法同时为其他天然产物的研究奠定了基础。
A method for determination of monosaccharides in Osmanthus fragrans by pre-column derivatization and high performance liquid chromatography-MS/MS
The invention discloses a method for detecting monosaccharide components in Osmanthus fragrans by pre-column derivatization HPLC MS/MS. The method is based on the pre column derivatization of 1 phenyl phenyl 3 methyl methyl 5 pyrazolone (PMP), and the simultaneous determination of 6 monosaccharides in Osmanthus fragrans by high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry. The method is simple, sensitive, highly selective, high separation efficiency, short injection volume, short analysis time, and multi mode determination, and is suitable for monosaccharide formation of polysaccharides in Osmanthus fragrans. The research provides scientific basis. This method also lays a foundation for the study of other natural products.
【技术实现步骤摘要】
一种柱前衍生化HPLC-MS/MS检测桂花中单糖含量的方法
本专利技术属于多糖组分分析领域，具体涉及一种柱前衍生化HPLC-MS/MS检测桂花中单糖组分的方法。
技术介绍
桂花(OsmanthusfragransLour)属于木犀科(Oleaceae)，是一种观赏植物，在中国南方和中部地区被用作传统民间药物，用于治疗多种疾病。其在中国用作药用植物数千年，并具有广泛的生物学效应，包括可以减弱炎症，作为抗氧化剂起作用，防止衰老并抑制黑素生成。此外，桂花提取物中的主要生物活性成分是类胡萝卜素和酚酸。来自天然药物多糖的分析是广泛的。多糖作为药物研究始于20世纪50年代，截至目前，已发现数百种多糖具有生物活性。多糖在抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、促进免疫等方面都发挥着重要生物活性，而且多糖是生物体内非常重要的一类有机化合物，除参与生物体的构造，作为能源物质、细胞识别的信息分子外，还参与体内物质转化代谢生成为生物体必须的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等。桂花多糖是桂花的重要成分之一，但是目前对桂花的研究主要集中在桂花精油方面，而对桂花多糖的单糖成分则很少有报道。HPLC-串联质谱法(HPLC-MS/MS)以其专属性强、灵敏度高等优势在中药有效成分含量测定中应用日益广泛。在过去十年中，专门用于分析糖和单糖的HPLC-MS方法的开发已经在灵敏度和特异性方面取得了显着进步，同时保持了实施的速度和简单性。然而，由于单糖的低电离效率，HPLC-MS方法受到灵敏度损失的限制，因此，单糖的衍生化对于获得高灵敏度检测是必不可少的。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化高效液相色谱法反应条件较温和，产物无立体异构，紫外检测灵敏度较高，故得到较为广泛的应用。然而，PMP柱前衍生化高效液相色谱与电喷雾电离质谱联用分析方法在桂花上的应用尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术不足而提供一种测定六种糖的柱前PMP衍生化HPLC-MS/MS方法。已经收集了六种PMP衍生的单糖的特征性碎片离子的数据。通过检测反应时间和中和条件，优化了柱前衍生化反应的步骤。应用该方法对三种不同品种的桂花中单糖含量进行分析，为桂花资源的开发利用提供依据。本专利技术采取的技术方案为：一种柱前PMP衍生化HPLC-MS/MS检测桂花中单糖组分的方法，包括步骤如下：(1)样品处理a、桂花中多糖的提取准确称取10g桂花、200ml的无水乙醇放入500ml圆底烧瓶后进行混合，80℃条件下在恒温水浴锅内冷凝回流一小时，过滤后取滤渣将此操作重复一次，再次过滤和干燥；然后再将得到的滤渣放置在1000ml的圆底烧瓶中并放入400ml的水，90℃条件下在恒温水浴锅中提取1.5h，重复两次；抽滤过后得到滤液，合并两次的滤液，将滤液在旋转蒸发仪内蒸发浓缩至150ml；将4倍体积的无水乙醇加入此浓缩的多糖溶液中，后经离心机离心15min(8000r/min)，干燥得到桂花粗多糖；将蒸馏水加入粗多糖溶解，再加入10ml的Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，剧烈振摇，室温下用离心机离心5min(3500r/min)；将4倍体积的无水乙醇加入取得的上清液中，沉淀用乙醇与丙酮洗涤，再经抽滤，干燥后得到桂花多糖；b、桂花中多糖的酸水解准确称取步骤a获得的桂花多糖10mg放入10ml的螺纹顶空瓶，加5ml的盐酸溶液(2mol/L)，混匀后密封，然后在90℃下水解3小时，冷却后，离心5min，取得上清液单糖样品水解液，待衍生化；c、单糖的PMP衍生化精密取桂花多糖水解液100μl，置于7ml离心管中，加入100μl1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液(0.5mol/L)，充分摇匀，在70℃水浴条件下反应30min，冷却室温，再加入适量10％冰乙酸溶液调PH至中性，混匀后加1ml氯仿用于萃取过量的PMP，弃掉下层液体，此操作重复3次，离心10min(转速8000r/min)后收集上清液，最后用0.22μm滤膜过滤，稀释到1000倍后待测；精密称取单糖对照品10mg，于10ml容量瓶中，加氨水至刻度线制成1mg/mL混合单糖标准溶液，依照上述方法PMP衍生处理后待测，所述对照品为甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖；分别精密称取单糖对照品10.0mg放入到10ml容量瓶中加入5ml氨水，配成2mg/ml的混合标准溶液；然后进行稀释得到一系列标准溶液，浓度依次为2μg/ml，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml，2ng/ml吸取各个标准系列溶液100μl，依照上述方法PMP衍生处理后待测；所述的6种单糖如下表所列：表1编号名称简称1甘露糖Man2核糖Rib3葡萄糖Glu4半乳糖Gal5木糖Xyl6岩藻糖Fuc(2)用高效液相色谱质谱联用仪检测：a、高效液相色谱HPLC的条件为色谱柱型号Shim-packVP-ODS6022748(150L×2.0)，柱温及检测器温度：30℃；流速：0.2mL/min；流动相：5mmol/L乙酸铵-乙腈，梯度洗脱程序：0-5mim17％乙腈；5-10min18％乙腈；10-15min19％乙腈；15-19min21％乙腈；19-25min18％乙腈25-40min15％乙腈；进样量：2μl；b、质谱MS/MS条件为离子源：电喷雾离子源，检测模式：正离子模式；加热块温度：400℃；DL加热管温度：250℃，扫描时间：0.1s，扫描模式：一级质谱Q3扫描，质谱扫描范围m/z100-1000、二级质谱产物离子扫描、多反应检测(multiplereactionmonition,MRM)模式定量分析，电喷雾电压：3.5KV，雾化气体：N2，雾化气流速：3.0L/min，干燥器流量：15.0L/min，碰撞气体：高纯氮气，碰撞气压力：230Kpa；(3)定性检测：取步骤(1)c经PMP衍生处理后6种单糖对照品的混合溶液，于步骤(2)条件下及如表2设定的质谱参数下进样测定；将步骤(1)c经PMP衍生处理后的桂花样品进样于上述条件下测定：样品经液相分离、质谱离子化后，根据每种单糖的保留时间、分子量、准分子离子峰等质谱参数(表2)对样品进行不同单糖及含量的确证。表2正离子模式下单糖标准品衍生化产物的主要质谱参数(4)定量检测：取步骤(1)c经PMP衍生处理后的一系列不同质量浓度的6种单糖对照品的混合溶液，于高效液相色谱质谱联用仪设定的条件下分别进样测定，重复6次，测定其对应浓度的色谱峰面积，进行线性回归，得到回归方程，相关系数和线性范围见表3；用线性方程对样品进行定量，样品中单糖的响应值应在仪器检测的线性范围内；表3混合单糖标准品的标准曲线、线性范围本专利技术的有益效果是：本专利技术运用的流动相是5mmol/L乙酸钠-乙腈梯度洗脱，采用梯度洗脱能得到更好的分离，提高糖在质谱中的检测灵敏度、缩短分离时间同时改善峰型。采用HPLC-MS/MS方法对桂花中的6种单糖成分进行同时测定，方法简单、灵敏、选择性高、分离效率高、进样量少、分析时间短、多模式测定等优点，为桂花中多糖的单糖成分研究提供科学依据。该方法同时为其他天然产物的研究奠定了基础。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种柱前PMP衍生化HPLC‑MS/MS检测桂花中单糖组分的方法，包括步骤如下：(1)样品处理a、桂花中多糖的提取准确称取10g桂花、200ml的无水乙醇放入500ml圆底烧瓶后进行混合，80℃条件下在恒温水浴锅内冷凝回流一小时，过滤后取滤渣将此操作重复一次，再次过滤和干燥；然后再将得到的滤渣放置在1000ml的圆底烧瓶中并放入400ml的水，90℃条件下在恒温水浴锅中提取1.5h，重复两次；抽滤过后得到滤液，合并两次的滤液，将滤液在旋转蒸发仪内蒸发浓缩至150ml；将4倍体积的无水乙醇加入此浓缩的多糖溶液中，后经离心机离心15min(8000r/min)，干燥得到桂花粗多糖；将蒸馏水加入粗多糖溶解，再加入10ml的Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，剧烈振摇，室温下用离心机离心5min(3500r/min)；将4倍体积的无水乙醇加入取得的上清液中，沉淀用乙醇与丙酮洗涤，再经抽滤，干燥后得到桂花多糖；b、桂花中多糖的酸水解准确称取步骤a获得的桂花多糖10mg放入10ml的螺纹顶空瓶，加5ml的盐酸溶液(2mol/L)，混匀后密封，然后在90℃下水解3小时，冷却后，离心5min，取得上清液单糖样品水解液，待衍生化；c、单糖的PMP衍生化精密取桂花多糖水解液100μl，置于7ml离心管中，加入100μl1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮甲醇溶液(0.5mol/L)，充分摇匀，在70℃水浴条件下反应30min，冷却室温，再加入适量10％冰乙酸溶液调PH至中性，混匀后加1ml氯仿用于萃取过量的PMP，弃掉下层液体，此操作重复3次，离心10min(转速8000r/min)后收集上清液，最后用0.22μm滤膜过滤，稀释到1000倍后待测；精密称取单糖对照品10mg，于10ml容量瓶中，加氨水至刻度线制成1mg/mL混合单糖标准溶液，依照上述方法PMP衍生处理后待测，所述对照品为甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖；分别精密称取单糖对照品10.0mg放入到10ml容量瓶中加入5ml氨水，配成2mg/ml的混合标准溶液；然后进行稀释得到一系列标准溶液，浓度依次为2μg/ml，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml，2ng/ml吸取各个标准系列溶液100μl，依照上述方法PMP衍生处理后待测；(2)用高效液相色谱质谱联用仪检测：a、高效液相色谱HPLC的条件为色谱柱型号Shim‑pack VP‑ODS6022748(150L×2.0)，柱温及检测器温度：30℃；流速：0.2mL/min；流动相：5mmol/L乙酸铵‑乙腈，梯度洗脱程序：0‑5mim17％乙腈；5‑10min18％乙腈；10‑15min19％乙腈；15‑19min21％乙腈；19‑25min18％乙腈25‑40min15％乙腈；进样量：2μl；b、质谱MS/MS条件为离子源：电喷雾离子源，检测模式：正离子模式；加热块温度：400℃；DL加热管温度：250℃，扫描时间：0.1s，扫描模式：一级质谱Q3扫描，质谱扫描范围m/z100‑1000、二级质谱产物离子扫描、多反应检测(multiple reaction monition,MRM)模式定量分析，电喷雾电压：3.5KV，雾化气体：N2，雾化气流速：3.0L/min，干燥器流量：15.0L/min，碰撞气体：高纯氮气，碰撞气压力：230Kpa；(3)定性检测：取步骤(1)c经PMP衍生处理后6种单糖对照品的混合溶液，于步骤(2)条件下及如表1设定的质谱参数下进样测定；将步骤(1)c经PMP衍生处理后的桂花样品进样于上述条件下测定：样品经液相分离、质谱离子化后，根据表1中每种单糖的保留时间、分子量、准分子离子峰等质谱参数对样品进行不同单糖及含量的确证；表1正离子模式下单糖标准品衍生化产物的主要质谱参数...
【技术特征摘要】
1.一种柱前PMP衍生化HPLC-MS/MS检测桂花中单糖组分的方法，包括步骤如下：(1)样品处理a、桂花中多糖的提取准确称取10g桂花、200ml的无水乙醇放入500ml圆底烧瓶后进行混合，80℃条件下在恒温水浴锅内冷凝回流一小时，过滤后取滤渣将此操作重复一次，再次过滤和干燥；然后再将得到的滤渣放置在1000ml的圆底烧瓶中并放入400ml的水，90℃条件下在恒温水浴锅中提取1.5h，重复两次；抽滤过后得到滤液，合并两次的滤液，将滤液在旋转蒸发仪内蒸发浓缩至150ml；将4倍体积的无水乙醇加入此浓缩的多糖溶液中，后经离心机离心15min(8000r/min)，干燥得到桂花粗多糖；将蒸馏水加入粗多糖溶解，再加入10ml的Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，剧烈振摇，室温下用离心机离心5min(3500r/min)；将4倍体积的无水乙醇加入取得的上清液中，沉淀用乙醇与丙酮洗涤，再经抽滤，干燥后得到桂花多糖；b、桂花中多糖的酸水解准确称取步骤a获得的桂花多糖10mg放入10ml的螺纹顶空瓶，加5ml的盐酸溶液(2mol/L)，混匀后密封，然后在90℃下水解3小时，冷却后，离心5min，取得上清液单糖样品水解液，待衍生化；c、单糖的PMP衍生化精密取桂花多糖水解液100μl，置于7ml离心管中，加入100μl1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液(0.5mol/L)，充分摇匀，在70℃水浴条件下反应30min，冷却室温，再加入适量10％冰乙酸溶液调PH至中性，混匀后加1ml氯仿用于萃取过量的PMP，弃掉下层液体，此操作重复3次，离心10min(转速8000r/min)后收集上清液，最后用0.22μm滤膜过滤，稀释到1000倍后待测；精密称取单糖对照品10mg，于10ml容量瓶中，加氨水至刻度线制成1mg/mL混合单糖标准溶液，依照上述方法PMP衍生处理后待测，所述对照品为甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖；分别精密称取单糖对照品10.0mg放入到10ml容量瓶中加入5ml氨水，配成2mg/ml的混合标准溶液；然后进行稀释得到一...
【专利技术属性】
技术研发人员：范宝磊，李婷婷，
申请(专利权)人：湖北科技学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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