一种提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法技术

本发明专利技术公开了一种提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法。本发明专利技术包括下列步骤：步骤1、软骨细胞的分离、培养、鉴定；步骤2、软骨细胞接种到培养器具中培养，细胞的培养过程中进行加载，在力学环境培养使细胞受到力学刺激。在力学环境培养下不但能够提高软骨细胞的增殖能力，而且还能促进共培养细胞具有良好的软骨表型，可迅速有效的为软骨组织工程提供优良的种子细胞，解决组织工程软骨种子细胞的临床和实际需求问题。

【技术实现步骤摘要】
一种提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法
本专利技术涉及一种提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法。
技术介绍
由创伤和各种疾病引起的关节软骨缺损在临床上十分常见，我国随着人口老龄化，患病人数与日俱增，但是关节软骨的自我修复作用非常有限，因此关节软骨损伤的修复重建一直是人们渴望解决的难题，关节软骨修复及相关研究显得尤为重要。组织工程在人类疾病治疗、康复、健康保障等方面具有重要的应用前景。组织工程中软骨组织工程给关节软骨缺损的修复带来了希望。当前国内外进行的软骨修复、重建主要通过组织工程的方法。种子细胞的选取是组织工程中最重要的环节和前提条件。以软骨细胞作为种子细胞的软骨组织修复工程，可改进修复组织的质量。软骨组织工程中，种子细胞如果在平常环境下进行体外扩增培养，细胞所形成的组织工程化软骨已证实缺乏应有的生物力学特性，从生物力学角度看，组织工程化软骨的种子细胞的获取及体外培养方法尚需改进。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题提供一种提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法，以迅速有效的为软骨组织工程提供优良的种子细胞，解决组织工程软骨种子细胞的临床和实际需求问题。为达到上述目的，本专利技术包括下列步骤：步骤1、软骨细胞的分离、培养、鉴定；步骤2、软骨细胞接种到培养器具中培养，细胞的培养过程中进行加载，在力学环境培养使细胞受到力学刺激。所述步骤2中的力学环境为：正弦波，拉伸幅度5%~15%，0.5Hz。所述步骤2还包括：将骨髓间充质干细胞接种到培养器具中与软骨细胞共同培养。所述步骤2中接种到培养器具中的骨髓间充质干细胞与软骨细胞的比例为2：1。所述步骤1中软骨细胞的分离、培养、鉴定的方法包括：切取哺乳动物的关节面软骨组织，将软骨片切成5mm×5mm小块，PBS液清洗2-3次；加入浓度为0.25%的胰酶/EDTA，37℃消化30min后，去上清液，加入浓度为0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃消化4-6h后，通过孔径为200目筛网滤去杂质，以1000r/min离心5min，去上清，加含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基制成细胞悬液，以1×109个/L的细胞浓度接种于培养瓶内，置于饱和湿度、37℃、体积分数5%的CO2培养箱培养，每3天换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况；待细胞长到80-90%时，0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，按1∶2的比例传代。取第3代细胞，用PBS洗涤2次，先制备细胞爬片，甲苯胺蓝染色阳性，提示软骨细胞分泌出软骨基质，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性。本专利技术还包括：步骤3、软骨细胞增殖活性检测、细胞的软骨表型检测。所述步骤3中软骨细胞增殖活性检测方法包括：软骨细胞用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸染色，细胞取样后通过流式细胞仪检测细胞的荧光强度来确定软骨细胞的增殖活性：增殖指数=。所述步骤3中细胞的软骨表型检测的方法包括：收集培养细胞的上清液，按照糖胺聚糖(GAG)ELISA定量检测试剂盒说明进行操作，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），并计算样品中糖胺聚糖(GAG)浓度；收集培养的细胞，采用RNAiso试剂盒提供的方法提取总RNA，然后进行逆转录反应合成cDNA；以cDNA为模板，以GAPDH为内参，按照RT-PCRKit试剂盒说明进行操作，分析Col2α1基因的表达情况。本专利技术的有益效果：在力学环境培养下可以提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型；其中力学加载方式为正弦波，拉伸幅度5%-10%，0.5Hz为最佳；软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养可以进一步提高软骨细胞的增殖能力，而力学环境共培养不但能够提高软骨细胞的增殖能力，而且还能促进共培养细胞具有良好的软骨表型；本专利技术迅速有效的为软骨组织工程提供优良的种子细胞，解决组织工程软骨种子细胞的临床和实际需求问题。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式及其结果做进一步详细的说明：图1为细胞生长力学环境的示意图（1：柔性基底六孔培养板；2：细胞；3：柔性基底膜；4：负压接口）；图2为静态培养软骨细胞组和共培养组软骨细胞的增殖指数比较统计图（n=6，*P<0.05，**P<0.001）；图3为软骨细胞组力学环境培养后软骨细胞的增殖指数比较统计图（n=6，**P<0.001）；图4为共培养组力学环境培养后软骨细胞的增殖指数比较统计图（n=6，**P<0.001）；图5为软骨细胞组和共培养组4d软骨细胞的增殖指数比较统计图（n=6，*P<0.05，**P<0.001）；图6为软骨细胞组和共培养组6d软骨细胞的增殖指数比较统计图（n=6，*P<0.05，**P<0.001）；图7为静态培养软骨细胞组和共培养组GAG表达比较统计图（n=6，**P<0.001）；图8为静态培养软骨细胞组和共培养组Col2α1基因相对表达量比较统计图（n=6，*P<0.05）；图9为力学环境培养软骨细胞组GAG表达比较统计图（n=6，**P<0.001）；图10为力学环境培养软骨细胞组Col2α1基因相对表达量比较统计图（n=6，*P<0.05）；图11为力学环境共培养组细胞GAG表达比较统计图（n=6，**P<0.001）；图12为力学环境共培养组细胞Col2α1基因表达比较统计图（n=6，*P<0.05，**P<0.001）；图13为软骨细胞组和共培养组细胞的GAG表达比较统计图（n=6，*P<0.05，**P<0.001）；图14为软骨细胞组和共培养组细胞的Col2α1基因表达比较统计图（n=6，*P<0.05）。具体实施方式1、软骨细胞的分离、培养与鉴定：取1月龄新西兰大白兔，耳缘静脉空气栓塞致死，剥离四肢皮肤，暴露膝关节，刮除关节周围附着的肌肉、骨膜、滑膜等组织，切取关节面软骨组织，将软骨片切成5mm×5mm小块，PBS液清洗2-3次。加入浓度为0.25%的胰酶/EDTA，37℃消化30min后，去上清液，加入浓度为0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃消化4-6h后，通过孔径为200目筛网滤去杂质，以1000r/min离心5min，去上清，加含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基制成细胞悬液，以1×109个/L的细胞浓度接种于培养瓶内，置于饱和湿度、37℃、体积分数5%的CO2培养箱培养，每3天换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。待细胞长到80-90%时，0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，按1∶2的比例传代。取第3代细胞，用PBS洗涤2次，先制备细胞爬片，甲苯胺蓝染色阳性，提示软骨细胞分泌出软骨基质，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性。2、骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定同一只新西兰大白兔的四肢骨，暴露骨髓腔，针头穿刺骨端用DMEM/F12培养液冲出骨髓腔中骨髓制成细胞悬液，加入有Percoll分离液的离心管内，细胞悬液与Percoll分离液体积比为1∶1，2000r/min离心20min，吸取有核细胞，PBS洗涤2次后，加含15%胎牛血清的DMEM/F本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法，其特征在于其包括下列步骤：步骤1、软骨细胞的分离、培养、鉴定；步骤2、软骨细胞接种到培养器具中培养，细胞的培养过程中进行加载，在力学环境培养使细胞受到力学刺激。

【技术特征摘要】
1.一种提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法，其特征在于其包括下列步骤：步骤1、软骨细胞的分离、培养、鉴定；步骤2、软骨细胞接种到培养器具中培养，细胞的培养过程中进行加载，在力学环境培养使细胞受到力学刺激。2.根据权利要求1所述的提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法，其特征在于所述步骤2中的力学环境为：正弦波，拉伸幅度5%~15%，0.5Hz。3.根据权利要求1所述的提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法，其特征在于所述步骤2还包括：将骨髓间充质干细胞接种到培养器具中与软骨细胞共同培养。4.根据权利要求3所述的提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法，其特征在于：所述步骤2中接种到培养器具中的骨髓间充质干细胞与软骨细胞的比例为2：1。5.根据权利要求1所述的提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法，其特征在于所述步骤1中软骨细胞的分离、培养、鉴定的方法包括：切取哺乳动物的关节面软骨组织，将软骨片切成5mm×5mm小块，PBS液清洗2-3次；加入浓度为0.25%的胰酶/EDTA，37℃消化30min后，去上清液，加入浓度为0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃消化4-6h后，通过孔径为200目筛网滤去杂质，以1000r/min离心5min，去上清，加含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基制成细胞悬液，以1×109个/L的细胞浓度接种于培...

【专利技术属性】
技术研发人员：王国辉，谢永芳，丛杨，杨晶，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37