一种可视化抗菌肽融合蛋白及其制备方法和其应用技术

本发明专利技术主要提供了一种在酵母中高效表达抗菌肽的方法。本发明专利技术所提供的方法包括将抗菌肽与一种红色荧光蛋白进行融合表达，在重组酵母中可以通过肉眼可见的颜色深浅判断菌株中抗菌肽产量的高低，以此快速筛选出高表达抗菌肽并具强抑菌活性的工程菌株。本发明专利技术还提供了一种具抑菌活性的重组融合蛋白和工程重组菌，所述重组蛋白和重组菌可直接应用于工业或饲料行业。

A Visual Antimicrobial Peptide Fusion Protein and Its Preparation and Application

The invention mainly provides a method for efficiently expressing antimicrobial peptide in yeast. The method provided by the invention includes fusing and expressing the antimicrobial peptide with a red fluorescent protein, and judging the yield of the antimicrobial peptide in the recombinant yeast by the visible color depth of the naked eye, so as to quickly screen the engineering strain with high expression of the antimicrobial peptide and strong antimicrobial activity. The invention also provides a recombinant fusion protein with bacteriostatic activity and an engineering recombinant bacterium, the recombinant protein and the recombinant bacterium can be directly applied to industry or feed industry.

【技术实现步骤摘要】
一种可视化抗菌肽融合蛋白及其制备方法和其应用
本专利技术属于基团工程领域，具体地，本专利技术涉及一种可视化抗菌肽融合蛋白及其制备方法和其应用。
技术介绍
抗菌肽(antibacterialpeptides)是一般由12～50个氨基酸残基组成的阳离子型(含过多的赖氨酸和精氨酸)的两性小分子多肽。在动物、植物和微生物中广泛存在，是宿主免疫防御系统的重要组成部分，其抗菌谱宽、免疫原性低，而且不易产生耐药性的特点及有抑制癌细胞生长的作用，这使得抗菌肽开发利用成为近年来的研究热点。但抗菌肽的开发利用并非易事，抗菌肽天然资源有限，提取非常复杂；化学合成，不但成本很高，还对环境造成严重污染。因此迫切需要一种廉价安全的生产技术来生产抗菌肽。基因工程生产方法可能是最经济的获得大量抗菌肽的方法。目前抗菌肽基因工程表达主要在大肠杆菌和酵母菌系统中进行。酵母菌表达体系具有直接分泌抗菌肽的能力，易于直接从发酵液中分离抗菌肽，相比大肠杆菌表达体系更易于大规模工业化生产。但是，由于抗菌肽是小分子含有多个碱性氨基酸的碱性多肽，极易受到蛋白酶的攻击。同时表达的产物往往对宿主细胞有毒性，会直接抑制宿主菌的生长，影响表达效率。因此抗菌肽的外源表达较其它多肽类药物更为困难。另外，筛选抗菌肽的高效表达工程菌时，通常采用抗菌肽有特殊的抗菌活性，通过抑菌实验筛选，那么每次就要对成千上万的转化子进行鉴定，先对每个转化子进行初步筛选，利用抗菌筛选抗菌活性相对较高的工程菌，再来进行复筛，这样要消耗大量的人力和物力。因此，如何解决抗菌肽免受蛋白酶的攻击，减少其对宿主细胞的毒害，以及如何筛选高效表达抗菌肽的酵母工程菌成为了抗菌肽事业发展的瓶颈。
技术实现思路
本专利技术提供了一种重组融合蛋白His-mApple-DP-AP，所述蛋白包括如下1)或2)所述的蛋白：1)具有序列表中的SEQID№.7所示的氨基酸序列的蛋白质；2)将序列表中的SEQID№.7的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽活性的由1)衍生的蛋白质。序列表中SEQID№.7所示的氨基酸序列由262个氨基酸残基组成。上述1)或2)所述的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行重组异源表达得到。上述1)或2)所述的蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQID№.7所示DNA序列缺失一个或几个编码氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。编码所述蛋白的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。本专利技术还提供了一种编码基因，所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：1)编码本专利技术所述蛋白的多核苷酸序列；2)序列表中SEQID№：2所示核苷酸序列；3)序列表中SEQID№：4所示核苷酸序列；4)序列表中SEQID№：5所示核苷酸序列；5)序列表中SEQID№：6所示核苷酸序列；6)在高严谨条件下可与序列表中SEQID№：6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；7)与1)、5)、或6)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。其中，序列表中的SEQID№：6由789个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-789位核苷酸，编码序列表中SEQID№：7所示的蛋白质，即本专利技术所述的重组融合蛋白His-mApple-DP-AP；序列表中的SEQID№：2由726个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-726位核苷酸，编码序列表中SEQID№：1所示的蛋白质，即本专利技术所述的添加his纯化标签的红色荧光重组蛋白his-mApple；序列表中的SEQID№：2为本专利技术所述的利用毕赤酵母密码子偏好性优化改造、并添加his纯化标签的红色荧光重组蛋白his-mApple的编码基因的核苷酸序列；序列表中的SEQID№：4由54个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-54位核苷酸，编码序列表中SEQID№：3所示的蛋白质，即本专利技术所述的蜜蜂抗菌肽AP；序列表中的SEQID№：4为本专利技术所述的利用毕赤酵母密码子偏好性优化改造的编码所述蜜蜂抗菌肽AP的核苷酸序列；序列表中的SEQID№：5由60个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-60位核苷酸，编码本专利技术所述的重组蛋白DP-AP；序列表中的SEQID№：5为本专利技术所所述添加了DP二肽的基因编码序列的经毕赤酵母密码子偏好性优化改造的编码所述蜜蜂抗菌肽AP的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌、和/或微生物，所述载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌、和/或微生物含有所述的编码基因。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。所述重组菌的出发菌株包括大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、和/或乳酸杆菌。所述酵母菌包括毕赤酵母、酿酒酵母、啤酒酵母细胞、和/或多型逊酵母细胞。所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对重组菌进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在宿主菌中表达具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化菌株。所述重组表达载体的出发载体具体为pPIC9和/或pYES2质粒；所述重组菌的出发菌株具体为毕赤酵母GS115和/或酿酒酵母INVSc1；所述重组表达载体具体为pPIC9-His-mApple-DP-AP和/或pYES2-His-mApple-DP-AP；所述重组菌具体为Pp-pPIC9-His-mApple-DP-AP和/或Sc-pYES2-His-mApple-DP-AP。扩增本专利技术所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本专利技术保护的范围。本专利技术还提供了一种酵母菌株，保藏号为CGMCCNo.14227。本专利技术还提供了一种蛋白的制备方法，所述方法包括：1)制备本专利技术所述的编码基因；2)制备包含步骤1)所述编码基因的重组表达载体；3)使步骤2)所述表达载体表达以获得目的蛋白。所述方法还包括所述目的蛋白的酸切割。本专利技术还提供了一种蛋白的制备方法，所述方法包括：1)发酵本专利技术所述的重组菌、和/或微生物；2)从发酵液中提取目标蛋白。所述方法还包括所述目标蛋白的酸切割。本专利技术的另一个目的是提供一种筛选产抗菌肽产品、筛选具抗菌肽相关活性的产品、降低抗菌肽降解几率和/或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白包括如下1)或2)所述的蛋白：1)具有序列表中的SEQ ID№.7所示的氨基酸序列的蛋白质；2)将序列表中的SEQ ID№.7的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽活性的由1)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白包括如下1)或2)所述的蛋白：1)具有序列表中的SEQID№.7所示的氨基酸序列的蛋白质；2)将序列表中的SEQID№.7的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽活性的由1)衍生的蛋白质。2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：1)编码权利要求1所述蛋白的多核苷酸序列；2)序列表中SEQID№：2所示核苷酸序列；3)序列表中SEQID№：4所示核苷酸序列；4)序列表中SEQID№：5所示核苷酸序列；5)序列表中SEQID№：6所示核苷酸序列；6)在高严谨条件下可与序列表中SEQID№：6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；7)与1)、5)、或6)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。3.一种载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌、和/或微生物，其特征在于，所述载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌、和/或微生物含有权利要求2所述的编码基因。4.一种引物对，其特征在于，所述引物对可扩增权利要求2所述编码基因全长或其任意片段。5.一种酵母菌株，保藏号为CGMCCNo.14227。6.一种蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：1)制备权利要求2所述的编码基因；2)制备包含步骤1)所述编码基因的重组表达载体；3)使步骤2)所述表达载体表达以获得目的蛋白。7.一种蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：1)发酵权利要求3所述的重组菌、和/或微生物；2)从发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，黄火清，华婷，罗会颖，王苑，柏映国，孟昆，涂涛，王亚茹，苏小运，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11