【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和生物医药领域，具体地说，涉及抗菌肽aod的制备方法和应用。
技术介绍
1、抗菌肽(amp)是一种存在于细菌、真菌、动物和植物体内的阳离子两亲性小分子多肽。这些天然肽分子量小，富含赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸(mwangi等，2019)。抗菌肽(amp)具有广谱抗菌活性，还具有抗真菌、病毒、寄生虫、免疫调节等功能。与常规抗生素不同，抗菌肽抑菌机理独特，常以多靶位点共同作用的方式进行杀菌，因此病原菌很难通过改变细胞膜的结构而产生抗性(lazzaro等，2020)。aod是从北美贻贝中分离得到的抗菌肽，由jung-kil seoy等人于2005年发现。它由38个氨基酸组成，包含3对二硫键(c4-c25,c11-c33，c15-c35)，分子量为4265da，等电点为9.18，带电荷数为5，疏水氨基酸约占其组成的34％(seo等，2005)。aod对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等菌株有较强的抑制作用(seo等，2021)。然而，由于aod的高电荷性和疏水性，目前还没有对其进行生物重组表达的相关报道；本专利技术前期尝试在毕赤酵母中经密码子优化后直接表达抗菌肽aod、使用传统大分子融合序列sumo和trx表达融合蛋白，但抗菌活性和蛋白电泳结果显示目的产物均未获得表达。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供抗菌肽aod的制备方法和应用。
2、为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供抗菌肽aod在制备抗菌药物或组合物中的应用；
3、所述菌包括但
4、抗菌肽aod的氨基酸序列如seq id no:1所示。
5、第二方面，本专利技术提供一种重组表达载体，所述重组表达载体携带如下基因表达框：诱导型启动子-编码α因子信号肽-kex2切割位点-融合序列6his-2fla-aod-终止密码子；
6、其中，所述融合序列6his-2fla-aod的氨基酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列如seq id no:3所示。
7、进一步地，在编码所述融合序列6his-2fla-aod的dna序列的5’端连接有xhoi酶切位点，3’端连接有xbai酶切位点。
8、优选地，出发载体为ppiczαa。
9、第三方面，本专利技术提供含有所述重组表达载体的宿主细胞，优选酵母细胞，更优选毕赤酵母细胞，如毕赤酵母细胞x-33。
10、第四方面，本专利技术提供一种基因工程菌，将所述所述重组表达载体线性化后导入毕赤酵母细胞内，筛选酵母转化子。
11、第五方面，本专利技术提供所述基因工程菌的培养方法，包括以下步骤：
12、1)种子液的制备：从ypd平板挑取酵母转化子单菌落，接种于含100μg/ml zeocin(博来霉素)的10ml ypd液体培养基中，30℃，250rmp，摇床培养18-24h，以1％v/v接种量接种于200ml ypd液体培养基中，30℃，250rmp，摇床培养16-18h，至od600nm值为5，即得种子液；
13、2)发酵培养：25℃-29℃下，按10％v/v的接种量将上述种子液加入2l基础盐培养基中，调ph值至5.0，加入9.6ml pmt1，通气量维持在8vvm，转速为600rpm，溶氧维持在20％以上，进行发酵培养；
14、3)饲喂碳源：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80％以上，开始流加含12‰pmt1的50％葡萄糖溶液，流加速度为12-24ml/l/min，连续流加6-8h，转速上调至1000rpm；
15、4)甲醇诱导：流加葡萄糖后，饥饿半小时，开始补加100％甲醇，由第一小时的流速1ml/l/min逐渐增加到第六小时的6ml/l/min，转速上调至1100rpm，ph上调至5.5，控制溶氧在20％以上，至发酵结束。
16、其中，步骤2)中使用的基础盐培养基的配方为：45g葡萄糖、50g nh4h2po4、20gk2so4、15g mgso4·7h2o、6g kh2po4、0.4g caso4和1.5g koh，加水定容至1l。
17、第六方面，本专利技术提供抗菌肽aod的制备方法，采用上述方法培养所述基因工程菌，并从发酵产物中分离抗菌肽aod。
18、借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
19、本专利技术使用融合标签fla-tag与抗菌肽aod进行结合，并设计优化基因序列进行合成，成功构建重组表达载体，获得融合蛋白，实现了抗菌肽aod在毕赤酵母中的高产表达，并建立完善的纯化和融合蛋白切割体系，从而实现规模化生产，可应用于抗菌药物、化妆品、饲料添加剂、兽药开发等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。同时，专利技术人还尝试了在毕赤酵母中经密码子优化后直接表达抗菌肽aod、融合序列sumo-aod和trx-aod，但是抗菌活性和蛋白电泳结果显示目的产物均未获得表达。
20、本专利技术首次发现抗菌肽aod对表皮葡萄球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、伪中间葡萄球菌、猪葡萄球菌具有抑制作用，进一步拓展了抗菌肽aod的抑菌谱。
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1.抗菌肽AOD在制备抗菌药物或组合物中的应用，其特征在于，所述菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、伪中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)；
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体携带如下基因表达框：诱导型启动子-编码α因子信号肽-Kex2切割位点-融合序列6His-2FLA-AOD-终止密码子；
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，在编码所述融合序列6His-2FLA-AOD的DNA序列的5’端连接有XhoI酶切位点，3’端连接有XbaI酶切位点。
4.根据权利要求2或3所述的重组表达载体，其特征在于，出发载体为pPICZαA。
5.含有权利要求2-4任一项所述重组表达载体的宿
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，其为毕赤酵母细胞。
7.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，其为毕赤酵母细胞X-33。
8.一种基因工程菌，其特征在于，将权利要求2-4任一项所述重组表达载体线性化后导入毕赤酵母细胞内，筛选酵母转化子。
9.权利要求8所述基因工程菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.抗菌肽AOD的制备方法，其特征在于，采用权利要求9所述方法培养所述基因工程菌，并从发酵产物中分离抗菌肽AOD。
...【技术特征摘要】
1.抗菌肽aod在制备抗菌药物或组合物中的应用，其特征在于，所述菌包括金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、停乳链球菌(streptococcus dysgalactiae)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、伪中间葡萄球菌(staphylococcus pseudintermedius)、猪葡萄球菌(staphylococcus hyicus)；
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体携带如下基因表达框：诱导型启动子-编码α因子信号肽-kex2切割位点-融合序列6his-2fla-aod-终止密码子；
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，在编码所述融合序列6his-2fla-aod的...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛若雨，赵庆伊，王建华，滕达，谷新晰，杨娜，郝娅，卢海强，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：
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