结核分枝杆菌脂蛋白G在制备抗病毒产品中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌脂蛋白G的新用途。本发明专利技术所提供的结核分枝杆菌脂蛋白G的新用途具体为LprG相关生物材料(结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌)在制备抗病毒产品中的应用。本发明专利技术发现结核分枝杆菌脂蛋白G(LprG)与抗病毒相关，且发现LprG与宿主细胞蛋白CypA互作。本发明专利技术对于抗病毒药物研发、为研发基于结核分枝杆菌‑宿主免疫应答界面的药物提供新靶标具有重要意义具有重要意义。

Application of Mycobacterium tuberculosis lipoprotein G in the preparation of antiviral products

The invention discloses a new use of lipoprotein G of Mycobacterium tuberculosis. The new application of the LprG-related biomaterials (Mycobacterium tuberculosis lipoprotein G or related polypeptide, nucleic acid molecule encoding Mycobacterium tuberculosis lipoprotein G, recombinant vector containing the nucleic acid molecule, expression box or recombinant bacteria) in the preparation of antiviral products is described in detail. The invention discovers that the lipoprotein G (LprG) of Mycobacterium tuberculosis is related to antiviral activity, and that LprG interacts with the host cell protein CypA. The invention is of great significance for the development of antiviral drugs and for the development of new targets for drugs based on the host immune response interface of Mycobacterium tuberculosis.

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌脂蛋白G在制备抗病毒产品中的应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种结核分枝杆菌脂蛋白G在制备抗病毒产品中的应用。
技术介绍
结核分枝杆菌脂蛋白G(LprG)是结核分枝杆菌H37RvRv1411c基因编码的一种脂蛋白，是结核分枝杆菌细胞膜的组成部分，也可被分泌到胞外以分泌蛋白的形式存在。环孢素A由11个氨基酸组成的环状多肽组成，属于强效免疫抑制剂。临床上主要用于肝、肾以及心脏移植的抗排异反应，也可与肾上腺皮质激素同用，治疗免疫性疾病。亲环素A(cyclophilinA,CypA)又称环孢素A(CsA)结合蛋白(cyclophilin)，是环孢素A的细胞内受体，介导环孢素A发挥免疫抑制作用。目前尚未有LprG与CypA互作的报道，也没有LprG与抗病毒相关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供结核分枝杆菌脂蛋白G的新用途。本专利技术所提供的结核分枝杆菌脂蛋白G的新用途，具体涉及如下几种：第一，LprG相关生物材料在制备抗病毒产品中的应用；所述LprG相关生物材料可选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。第二，LprG相关生物材料在如下任一中的应用：(1)制备用于抑制病毒繁殖的产品；(2)制备用于破坏病毒颗粒形态的产品；(3)制备用于降低病毒致病力的产品；所述LprG相关生物材料可选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。在上述两个应用中，所述病毒具体可为艾滋病毒或流感病毒。第三，LprG相关生物材料在如下任一中的应用：(1)干扰HIV假病毒包装和/或繁殖，或者制备用于干扰HIV假病毒包装和/或繁殖的产品；(2)促进流感病毒的M1蛋白降解，或者制备用于促进流感病毒的M1蛋白降解的产品；所述LprG相关生物材料可选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。第四，结核分枝杆菌脂蛋白G在作为亲环素A的互作蛋白中的应用。第五，LprG相关生物材料在分离、纯化、富集和/或筛选亲环素A，或者制备用于分离、纯化、富集和/或筛选亲环素A的产品中的应用；所述LprG相关生物材料可选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。在本专利技术中，所述结核分枝杆菌脂蛋白G的氨基酸序列具体为序列表中序列1。相应的，编码所述结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子具体为序列表中序列2所示的DNA分子。所述亲环素A的氨基酸序列具体为序列表中序列3。本专利技术首次发现结核分枝杆菌脂蛋白G(LprG)与抗病毒相关，且发现LprG与宿主细胞蛋白CypA互作。本专利技术对于抗病毒药物研发、为研发基于结核分枝杆菌-宿主免疫应答界面的药物提供新靶标具有重要意义。附图说明图1为LprG干扰HIV假病毒包装和/或繁殖结果。*表示在P<0.05水平上差异显著。图2为LprG促进流感病毒的M1蛋白降解结果。*表示在P<0.05水平上差异显著。图3为LprG与CypA互作研究中的荧光聚焦共定位实验结果。图4为LprG与CypA互作研究中的pull-down实验结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。293T细胞：ATCC,CRL-3216。pNL43R-E-luciferase质粒和pcDNA3.1-env质粒：记载于“ShangH,HanX,ShiX,etal.GeneticandneutralizationsensitivityofdiverseHIV-1envclonesfromchronicallyinfectedpatientsinChina.[J].JournalofBiologicalChemistry,2011,286(16):14531-41.”一文，公众可从申请人处获得，尽可用于重复本专利技术实验使用。ghost细胞：在无菌环境中，从6-8周的小鼠取血1mL，加入500μL3.8％的柠檬酸钠，在4℃2000rpm的条件下离心5min，弃上清后，用1mL预冷的PBS洗3次。然后加入低渗缓冲液(10mMTris，0.1mMEDTA，1mMCaCl2，pH7.4)，冰上放置5分钟，在4℃下以9000rpm离心5分钟以除去细胞内容物。再用预冷的低渗缓冲液洗涤三次。再加入PBS，冰上放置20min。再通过在4℃以9000rpm离心5分钟收集ghost细胞。用PBS将ghost细胞最终体积调节至100μL，用于细胞培养。pCI-eGFP-M1质粒：以pCI(Promega公司产品)为原始质粒，通过酶切位点NheI-EcoRI插入eGFP(序列6)，通过酶切位点EcoRI-SalIM1插入M1(序列7)后得到的重组质粒。引物分别为：eGFP-for：5’-CTAGCTAGCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’；eGFP-rev：5’-CCGGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’。M1-for：5’-CCGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGGTC-3’；M1-rev：5’-ACGCGTCGACTCACTTGAACCGTTGCATCTG-3’。实施例1、LprG干扰HIV假病毒包装和/或繁殖一、实验步骤1.细胞铺板：293T细胞按2×106接种于6孔板，转染时细胞密度达到70-80％。2.转染前，采用200ng/ml药物环孢素A即CsA或300ng/mLLprG蛋白(氨基酸序列为序列表中序列1，对应的编码基因的序列为序列表中序列2)预处理30min。3.转染试剂准备：pNL43R-E-luciferase质粒、pcDNA3.1-env质粒按照4：1(质量比)混合，DMEM稀释后加入转染试剂Nenofect，室温静止15分钟。4.将混合物加入293T细胞培养液中，继续培养48h，包装病毒。5.收集上清，4℃，3000rpm，离心5min，去除细胞碎片，得到HIV假病毒。6.感染ghost细胞：ghost细胞按照2×104接种于96孔板，过夜培养后，加入50μl步骤5包装的假病毒。7.继续培养48h，测荧光酶素值变化。实验同时设置没有加入HIV假病毒的对照组(buffer是加入PBS做对照，blank是什么都不加)，以及加入HIV假病毒但不提前经用CsA或LprG预处理的对照组。实验中，每个处理组设置三个重复，结果取均值。二、实验结果结果如图1所示。buffer和blank表示没有加入HIV假病毒的实验组，作为实验的负对照，基本上测不到萤光素酶的活性。加入HIV假病毒组，萤光素酶活性大大提高，表明病毒侵入以及包装繁殖正常，提前用CsA或LprG预处理的细胞，加入HIV假病毒，萤光素酶活性明显下降(P<0.05)，表明LprG具有和CsA相似的作用，干扰HIV假病毒的包装和繁殖。因此，LprG具有抑制HIV病毒繁殖的功能。实施例2、LprG促进流感本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.LprG相关生物材料在制备抗病毒产品中的应用；所述LprG相关生物材料选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。

【技术特征摘要】
1.LprG相关生物材料在制备抗病毒产品中的应用；所述LprG相关生物材料选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。2.LprG相关生物材料在如下任一中的应用：(1)制备用于抑制病毒繁殖的产品；(2)制备用于破坏病毒颗粒形态的产品；(3)制备用于降低病毒致病力的产品；所述LprG相关生物材料选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述病毒为艾滋病毒或流感病毒。4.LprG相关生物材料在如下任一中的应用：(1)干扰HIV假病毒包装和/或繁殖，或者制备用于干扰HIV假病毒包装和/或繁殖的产品；(2)促进流感病毒的M1蛋白降解，或者制备用于促进流感病毒的M1蛋白降解的产品；所述LprG相关生物材料选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核...

【专利技术属性】
技术研发人员：米凯霞，李晓静，陈榕，周怡璇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11