一种利用微生物制备环孢菌素的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用微生物制备环孢菌素的方法，属于微生物次级代谢产物应用领域。主要技术方案如下：活化地生弯颈霉菌C41‑3：将地生弯颈霉菌C41‑3接种在灭菌的PDA培养基上，置于25℃的常温培养箱，培养7天；制备种子液：将活化后的地生弯颈霉菌C41‑3置于原液体培养基中，在28℃、120r/min培养5d得到种子液；制备发酵液：将种子液按8vt％的接种量接种于察氏液体培养基中，在24℃、120r/min条件下摇床培养5d得到发酵液；环孢菌素的制备。本发明专利技术提供一种利用微生物制备环孢菌素的方法，缓解了环孢菌素A供不应求的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种利用微生物制备环孢菌素的方法
本专利技术属于微生物次级代谢产物应用领域，更具体地说是一种利用微生物制备环孢菌素的方法。
技术介绍
免疫抑制剂环孢菌素A(CyclosporineA，CsA)是由11个氨基酸组成的环肽。其分子量为1202，其中含有一个由9个碳组成含乙烯双键的氨基酸。由NMR(核磁共振测定)及MS(质量光谱测定法)测定结果推断其分子式为C62H111N11O12。环孢菌素A对B细胞和巨噬细胞增殖和功能没有直接的抑制作用，这一点对移植耐受性的形成很有意义。已有的研究表明小分子免疫抑制剂联合使用时，作用位点相同的药物联合使用对疗效具有拮抗作用，且毒性增加，而联合使用作用机制不同的药物，则能够降低毒性和提高疗效。环孢菌素A的免疫抑制作用使其主要用于器官移植时的抗排斥反应和移植物抗宿主病(GVHD)的治疗。随着对环孢菌素A作用机制的不断认识，以及临床某些疾病的发病机制的不断明确，目前环孢菌素A已不仅应用于抗排斥反应。近年来，该药在治疗免疫系统有关的疾病方面，特别是自身免疫性疾病方面也得到了肯定的评价。
技术实现思路
为弥补现有技术中环孢菌素A产量不足的问题，本专利技术提供一种利用微生物制备环孢菌素的方法，具有制备方法简单易行、产量高的特点。本专利技术的技术方案如下：一种利用微生物制备环孢菌素的方法，包括如下步骤：(1)活化地生弯颈霉菌C41-3：将地生弯颈霉菌C41-3接种在灭菌的PDA培养基上，置于25℃的常温培养箱，培养7天；所述的PDA培养基配方为：马铃薯100g、葡萄糖10g、琼脂10g、水500mL；(2)制备种子液：将活化后的地生弯颈霉菌C41-3置于原液体培养基中，在28℃、120r/min培养5d得到种子液；所述原液体培养基配方为：葡萄糖50g，蛋白胨10g，KNO32g，MgSO42g，CaCl20.1g，(NH4)3PO4·3H2O2g，水1000mL，装液量为2/5；本专利技术所述装液量为培养基占盛装培养基容器的体积比；(3)制备发酵液：将种子液按8vt％的接种量接种于察氏液体培养基中，在24℃、120r/min条件下摇床培养5d得到发酵液；所述察氏液体培养基的配方为蔗糖30g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO40.5g，KCl0.5g，FeSO40.01g，水1000mL，pH为5.0；所述察氏液体培养基的装液量为2/5；(4)环孢菌素的制备：向步骤(3)制备的发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，将发酵液和菌丝体全部浸泡，在24℃、120r/min条件下摇床培养24h后，超声震荡30min，静置待其分层后取出上层有机相到无菌锥形瓶，静置、过滤、浓缩得到环孢菌素，此步骤操作时，可将发酵液和菌丝体分次加入乙酸乙酯，再将多次分离得到的有机相合并。本专利技术所述环孢菌素均为环孢菌素A。地生弯颈霉菌株(Tolypocladiumgeodes)C41-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO15667，保藏日期为2018年4月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术使用的地生弯颈霉C41-3，由大连民族大学真菌研究实验室从长白山北坡森林土壤中分离，5℃-30℃范围内均能生长，25℃时产孢量最大，pH4至pH9范围内均能生长。最适生长温度为25℃，最适生长的pH值为6。本专利技术的有益效果如下：地生弯颈霉菌株(Tolypocladiumgeodes)C41-3，该真菌为喜冷真菌，其产生的次级代谢产物环孢菌素A广泛应用到医药领域和生物农药领域，本专利技术对解决环孢菌素A供不应求作出了贡献，探究得到一种高产环孢菌素A的高产微生物及最佳培养基和生长调节，并从发酵液中提取环孢菌素A，提取时用乙酸乙酯将发酵物(发酵液和菌丝体)完全浸泡后，在24℃、120r/min条件下摇床培养24h后，超声震荡30min，大大提高了环孢菌素的提取率。附图说明图1为本专利技术的标准曲线；图2为不同培养基对环孢菌素产量的影响；图3为培养基初始pH对环孢菌素产量的影响；图4为接种量对环孢菌素产量的影响；图5为培养时间对环孢菌素产量的影响；图6为装液量对环孢菌素产量的影响；图7为培养温度对环孢菌素产量的影响。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术做进一步的说明，若无特殊说明，本专利技术所用原料及设备均为本领域的常规技术手段。实施例1地生弯颈霉菌株(Tolypocladiumgeodes)C41-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO15667。(1)活化地生弯颈霉菌C41-3：将地生弯颈霉C41-3母菌株，用灭菌的牙签挑出母菌菌丝，接种在灭菌的PDA培养基上，分别接种到5个灭菌的培养皿上，置于25℃的常温培养箱，培养7天；所述的PDA培养基配方为：马铃薯100g、葡萄糖10g、琼脂10g、水500mL；(2)制备种子液：活化后的地生弯颈霉菌C41-3在超净台，用6cm的灭菌并用酒精灯火焰灼烧过的打孔器，打三个菌饼，用灭菌的镊子放入200mL已灭菌的原液体培养基中，在28℃、120r/min培养5d得到种子液；所述原液体培养基配方为：葡萄糖50g，蛋白胨10g，KNO32g，MgSO42g，CaCl20.1g，(NH4)3PO4·3H2O2g，水1000mL，装液量为2/5；(3)发酵液制备：将种子液按8vt％的接种量接种于察氏液体培养基中，在24℃、120r/min条件下摇床培养5d得到发酵液；所述察氏液体培养基的配方为蔗糖30g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO40.5g，KCl0.5g，FeSO40.01g，水1000mL，pH为5.0；所述察氏液体培养基的装液量为2/5；(4)环孢菌素的制备：a.用刀将菌丝体切碎；b.向发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，保证发酵液和菌丝体被完全浸泡；c.用乙酸乙酯将发酵液完全浸泡后，用铝箔(或封口膜)封口，在24℃、120r/min条件下摇床培养24h后，在室温(28℃)用超声波辅助提取30min，静置待其分层后取出上层有机相到无菌锥形瓶，此提取步骤重复6次，收集6次的有机相；d.静置，待发酵液和有机相乙酸乙酯分层，用三角漏斗，中速滤纸过滤上层有机相，滤液中加入过量无水硫酸镁干燥，以无水硫酸镁粉末不结块为宜，收集有机相(3-5次)；e.将收集的有机相经减压浓缩(水浴温度≤40℃)；f.吹干、称重然后低温保存(2-8℃)即得环孢菌素。对比例1不同培养基对环孢菌素产量的影响8种不同培养基配方：原始培养基(C8)：葡萄糖50g，蛋白胨10g，KNO32g，MgSO42g，CaCl20.1g，(NH4)3PO4·3H2O2g，水1000mL；马铃薯葡萄糖培养基(PD)：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL；马铃薯蛋白胨葡萄糖培养基(PPD)：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，水1000mL；马铃薯葡萄糖酵母粉培养(PDY)：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉10g，水1000mL；萨氏培养基(SDY)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，酵母粉10g，水1000mL；萨氏麦芽糖培养基(SMY)：蛋白胨10g，麦芽糖40g，酵母粉10g，水1000mL；肉汤培养基(LB)：蛋白胨10gNaCl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用微生物制备环孢菌素的方法，其特征在于，包括如下顺序的步骤：(1)活化地生弯颈霉菌C41‑3：将地生弯颈霉菌C41‑3接种在灭菌的PDA培养基上，置于25℃的常温培养箱，培养7天；所述的PDA培养基配方为：马铃薯100g、葡萄糖10g、琼脂10g、水500mL；(2)制备种子液：将活化后的地生弯颈霉菌C41‑3置于原液体培养基中，在28℃、120r/min培养5d得到种子液；所述原液体培养基配方为：葡萄糖50g，蛋白胨10g，KNO3 2g，MgSO4 2g，CaCl2 0.1g，(NH4)3PO4·3H2O 2g，水1000mL，装液量为2/5；(3)制备发酵液：将种子液按8vt％的接种量接种于察氏液体培养基中，在24℃、120r/min条件下摇床培养5d得到发酵液；所述察氏液体培养基的配方为蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，水1000mL，pH为5.0，所述察氏液体培养基的装液量为2/5；(4)环孢菌素的制备：向发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，将发酵液和菌丝体全部浸泡；在24℃、120r/min条件下摇床培养24h后，超声震荡30min，静置待分层后取出上层有机相，静置、过滤、浓缩得到环孢菌素。...

【技术特征摘要】
1.一种利用微生物制备环孢菌素的方法，其特征在于，包括如下顺序的步骤：(1)活化地生弯颈霉菌C41-3：将地生弯颈霉菌C41-3接种在灭菌的PDA培养基上，置于25℃的常温培养箱，培养7天；所述的PDA培养基配方为：马铃薯100g、葡萄糖10g、琼脂10g、水500mL；(2)制备种子液：将活化后的地生弯颈霉菌C41-3置于原液体培养基中，在28℃、120r/min培养5d得到种子液；所述原液体培养基配方为：葡萄糖50g，蛋白胨10g，KNO32g，MgSO42g，CaCl20.1g，(NH4)3PO4·3H2O2g，水1000mL，装液量为2/5；(3)制备发酵液：将种子液按8vt％的接种量接种于察氏液体培养基中，在24℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏丹，施宏梅，吕国忠，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21