鸡Ⅱ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，本发明专利技术公开了鸡Ⅱ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组，根据鸡Ⅱ型星状病毒基因组保守序列设计引物：外引物F3和B3，序列见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2；内引物FIP和BIP，序列见SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。本发明专利技术还公开了鸡Ⅱ型星状病毒检测试剂盒，包括上述引物组。本发明专利技术又公开了鸡Ⅱ型星状病毒环介导等温扩增检测方法：根据所设计的引物建立一种检测鸡Ⅱ型星状病毒的环介导等温扩增方法。本发明专利技术的检测方法具有快速、高效、特异性强、准确性好、灵敏度高、无需昂贵仪器设备，便于基层现场使用，方便快速。

Ring-mediated Isothermal Amplification for Detection of Chicken Star Virus Type II: Primers, Kits and Detection Methods

The invention belongs to the field of biotechnology. The invention discloses a group of RING-mediated isothermal amplification detection primers for chicken type II stellate virus. According to the conservative sequence of chicken type II stellate virus genome, the primers are designed as follows: external primers F 3 and B3, SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2; internal primers FIP and BIP, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4. The invention also discloses a chicken stellate virus type II detection kit, including the primers mentioned above. The invention also discloses a RING-mediated isothermal amplification detection method for chicken type II stellate virus: a RING-mediated isothermal amplification method for detecting chicken type II stellate virus is established according to the designed primers. The detection method of the invention has the advantages of fast, high efficiency, strong specificity, good accuracy, high sensitivity, no expensive instrument and equipment, and is convenient for field use at the grass-roots level, and is convenient and fast.

【技术实现步骤摘要】
鸡Ⅱ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种鸡星状病毒环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及其检测方法，属于生物

技术介绍
星状病毒科（Astroviridae）分为哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus）和禽星状病毒属(Avastrovirus)，其中禽星状病毒属分为3个种，分别为禽星状病毒GI.A型、禽星状病毒GI.B型和禽星状病毒GII.A型。根据不同来源和基因型，在家禽中鉴定出来6种不同的星状病毒，包括两种鸡源星状病毒（禽肾炎病毒（ANV）和鸡星状病毒（CAstV））、两种火鸡源星状病毒（TAstV-1和TAstV-2）和两种鸭源星状病毒（DAstV-1和DAstV-2）。星状病毒是单股正链、无囊膜的小RNA病毒，其基因组长度为6.5-7.5kb，有3个开放阅读框（ORF），包括阅读框编码的无囊膜蛋白（ORF1a）、病毒RNA依赖的RNA聚合酶（ORF1b）和衣壳蛋白（ORF2）。其复制方式与其他肠道病毒在合成次基因组时是截然不同的，在ORF1与ORF2之间存在一个含有丝氨酸蛋白酶的反转录移框信号序列，ORF1a和ORF1b之间有一个移动框结构，ORF1编码一种蛋白酶和RNA依赖的RNA聚合酶，ORF2表达亚基因组RNA，编码病毒的衣壳蛋白，不同血清型之间的结构长短不一。鸡星状病毒（CAstV）是一种极易在1-5周龄幼禽中流行的肠道病毒，常与其他肠道病毒发生混合感染。对鸡群肠道病毒感染情况进行持续监测，发现检测到的首个阳性样本往往就是星状病毒或星状病毒与其他病毒的混合感染。检测该病毒的感染情况对于疾病控制和临床诊断均具有重要意义。因此，一套简便快速、特异性强的星状病毒检测方法，可以为鸡腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持。环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）方法可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列，LAMP具有许多独特的优点：①LAMP技术可以在等温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高。②LAMP技术扩增的特异性非常高，使用的特异性引物可以识别目的序列上特异性的区域，对目的序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响。③阳性扩增反应中会产生大量的焦磷酸镁白色沉淀，扩增产物的检测方法多样，可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加入染料，根据颜色的变化通过荧光照射装置进行紫外光照射检测；还可以利用浊度仪，根据扩增产物混浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析。此外，LAMP方法还具有特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度（60℃～66℃），大大降低了检测的费用，特别适合基层现场使用。目前，还未见针对鸡Ⅱ型星状病毒LAMP方法的相关研究报道，本专利技术的建立可填补国内外相关领域空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鸡Ⅱ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及其检测方法，应用该引物组可为基层现场检测提供一种简便、快捷的检测鸡Ⅱ型星状病毒的方法。本专利技术的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：所述检测鸡Ⅱ型星状病毒的环介导等温扩增方法技术的核心在于引物的设计，设计出特异性强的引物是LAMP的关键。引物组是由一对外引物、一对内引物组成，其中所述的外引物由F3和B3、内引物由FIP和BIP组成。根据GenBank中登录的所有鸡Ⅱ型星状病毒基因组序列特征，利用分子生物学软件进行分析比较，选择鸡Ⅱ型星状病毒基因组保守区域片段，设计引物，包括外引物1对（CAstVⅡ-F3和CAstVⅡ-B3）和内引物1对（CAstVⅡ-FIP和CAstVⅡ-BIP），具体序列见SEQID设计的引物序列为：CAstVⅡ-F3：5’-CTGTGGCATGACGATTACGA-3’；CAstVⅡ-B3：5’-TCGACGCAATTGATCTGCTT-3’；CAstVⅡ-FIP：5’-GAGCGCTTTGTAGGACCTCGCATGGTCTTATGTCGGA-3’；CAstVⅡ-BIP：5’-ATCGAGCACTGGGGGTAAGTAGTCCTTTACGTCGGATCT-3本专利技术的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种含所述引物组的检测试剂盒，所述试剂盒还包括：SYBRGreenⅠ荧光染料、2×反应缓冲液、所述的引物组、BstDNA聚合酶、超纯水。本专利技术的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：鸡Ⅱ型星状病毒检测试剂盒的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP检测方法对应的LAMP反应体系为25μL：2×反应缓冲液12.5μL，引物CAstVⅡ-F3(25pmol)1.0μL，引物CAstVⅡ-B3(25pmol)1.0μL，引物CAstVⅡ-FIP(50pmol)0.5μL，引物CAstVⅡ-BIP(50pmol)0.5μL，BstDNA聚合酶1μL，待检样品cDNA模板1.0μL，甜菜碱终浓度为4mol/L，荧光目视检测试剂SYBRGreenⅠ荧光染料1.0μL，其余用超纯水补足至25.0μL，然后于62℃反应40min。所述的检测试剂采用SYBRGreenⅠ荧光染料，荧光试剂在反应前加入。所述的2×反应缓冲液，包括pH8.8Tris-HCl为40mM、KCl为20mM、MgSO4为16mM、(NH4）2SO4为20mM、Tween20为0.2wt.%、Betaine为1.6M、dNTPsmixture每种均为2.8mM。说明：反应前在PCR管内盖上加入1μLSYBRGreenⅠ荧光染料，LAMP反应结束后瞬时离心，于紫外灯下观察。若反应管中有目的DNA的大量扩增，则反应管颜色呈现强烈绿色荧光，反之无荧光。本专利技术还提供了所述的环介导等温扩增反应的引物组在制备鸡Ⅱ型星状病毒快速诊断试剂中的用途。本专利技术的优点在于：1.灵敏度高，特异性强：LAMP方法具有高特异性和高扩增效率。由于LAMP方法使用4种识别模板DNA上6个不同区域的引物，其特异性极高。2.操作简单，成本较低：LAMP反应的几个方面与其他扩增方法不同。LAMP方法的主要特征是只需要一种酶，使其在62℃范围内的等温条件下扩增核酸。因此，它允许使用简单且具有低成本效益的反应设备，在临床检测中可以更好的实施。3.效率高，时间短：LAMP方法的分离效率非常高，等温也不需要变温过程的时间浪费。LAMP方法在30～60min内对25μL反应混合物合成10～20μL特异性DNA。4.特异性强、灵敏度高：本专利技术建立的LAMP方法检测出鸡Ⅱ型星状病毒，所检测的阴性对照样品（如鸡新城疫病毒、家禽腺病毒、禽白血病病毒、鸡马立克氏病毒和鸡传染性支气管炎病毒）和水对照样品均无阳性结果出来，和PCR检测结果一致。但是LAMP方法较常规PCR灵敏度高100倍左右，最低检测限为105copy/μL。附图说明图1为鸡Ⅱ型星状病毒LAMP特异性实验（直接观察），其中1：鸡Ⅱ型星状病毒；对照家禽病毒4种，分别为：2：鸡新城疫病毒；3：禽腺病毒；4：禽白血病病毒；5：鸡马立克氏病毒；6：鸡传染性支气管炎病毒图2为鸡Ⅱ型星状病毒LAMP方法敏感性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡Ⅱ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的引物组由1对外引物F3和B3、1对内引物FIP和BIP组成，F3、 B3、FIP、BIP引物序列如下：CAstV Ⅱ‑F3：5’‑CTGTGGCATGACGATTACGA‑3’；CAstV Ⅱ‑B3：5’‑TCGACGCAATTGATCTGCTT‑3’；CAstV Ⅱ‑FIP：5’‑GAGCGCTTTGTAGGACCTCGCATGGTCTTATGTCGGA‑3’；CAstV Ⅱ‑BIP：5’‑ATCGAGCACTGGGGGTAAGTAGTCCTTTACGTCGGATCT‑3。

【技术特征摘要】
1.一种鸡Ⅱ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的引物组由1对外引物F3和B3、1对内引物FIP和BIP组成，F3、B3、FIP、BIP引物序列如下：CAstVⅡ-F3：5’-CTGTGGCATGACGATTACGA-3’；CAstVⅡ-B3：5’-TCGACGCAATTGATCTGCTT-3’；CAstVⅡ-FIP：5’-GAGCGCTTTGTAGGACCTCGCATGGTCTTATGTCGGA-3’；CAstVⅡ-BIP：5’-ATCGAGCACTGGGGGTAAGTAGTCCTTTACGTCGGATCT-3。2.鸡Ⅱ型星状病毒检测试剂盒，包括权利要求1所述的鸡Ⅱ型星状病毒环介导等温扩增检测引物组、SYBRGreenⅠ荧光染料、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、超纯水。3.如权利要求2所述的鸡Ⅱ型星状病毒检测试剂盒的LAMP检测方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱琨，乔丹丹，武宗仪，秦爱建，邵红霞，叶建强，金文杰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32