本发明专利技术公开了一种致弱的传染性法氏囊病病毒，其保藏名称：传染性法氏囊病病毒IBDV/1F，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：V201834，保藏日期：2018年7月3日。本发明专利技术还同时提供了上述致弱的传染性法氏囊病病毒的用途：用于制备疫苗，该病毒株不引起鸡的法氏囊损伤，又可以诱导产生高滴度的针对鸡传染性法氏囊病病毒的抗体；该疫苗能抵御强毒株的攻击，且对鸡只的发育没有影响。
Weakening Virus for Prevention of Infectious Bursal Disease in Chicken and Its Use
The invention discloses a weakened infectious bursal disease virus, its preservation name: IBDV/1F, the preservation unit: China Typical Culture Preservation Center, the preservation address: Wuhan University of China, the preservation number: CCTCC NO: V201834, the preservation date: July 3, 2018. The invention also provides the use of the aforementioned attenuated infectious bursal disease virus for preparing a vaccine, which does not cause bursal damage in chickens and can induce high titer of antibodies against infectious bursal disease virus in chickens; the vaccine can resist the attack of the virulent strain and has no effect on the development of chickens. Ring.
【技术实现步骤摘要】
用于预防鸡传染性法氏囊病的致弱病毒及用途
本专利技术属于生物
，涉及一株能有效预防传染性法氏囊病病毒感染的致弱病毒及其用途。
技术介绍
鸡传染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus，IBDV)引起的一种主要危害3～6周龄雏鸡的急性、高度接触性传染病，主要侵害病鸡的中枢免疫器官——法氏囊，以法氏囊发炎、坏死和萎缩为主要病理特征，法氏囊内B淋巴细胞严重受损并导致严重的免疫抑制。IBDV病毒粒子无囊膜，呈正二十面体对称，基因组由A、B两个dsRNA节段组成，编码VP1～5共五种病毒蛋白，其中，VP1、VP2和VP3是公认的结构蛋白。VP1参与基因组dsRNA的连接和基因组的复制，是RNA依赖的RNA聚合酶，在病毒粒子中含量仅为3％左右；VP2构成了病毒粒子的外表面，VP2是IBDV的主要中和抗原，在病毒粒子中含量超过50％，但它的核苷酸序列容易在疫苗的选择压力下发生突变；VP3还具有dsRNA结合功能，参与病毒粒子的组装，协助VP1蛋白介导的病毒基因组复制，行使类似核衣壳蛋白的功能，组成了病毒粒子的外表面，约占病毒总蛋白量的35％。VP2蛋白特定位置的氨基酸序列被报道与IBDV的毒力有关，VP1也被报道参与决定IBDV的毒力。因病毒毒力的不同，鸡群感染后死亡率差异较大，但即使耐过鸡群也会发生显著的免疫抑制，这对鸡群的计划免疫造成严重影响，增加鸡传染病防控的难度。IBDV已传遍我国各地，某些地区发病率高达80％。当前，免疫接种预防依然是防控IBD最主要的方法，但开发的IBD疫苗存在以下问题：活疫苗仍然可以导致一定的法氏囊损伤，影响鸡只生长发育，降低肉料比；在免疫选择压力下，变异毒株不断涌现，疫苗研发滞后。目前已有的致弱毒株都是改变或修饰IBDV病毒的中和抗原VP2蛋白的氨基酸序列而达到致弱的目的，这具有改变病毒免疫原性不能与流行的亲本毒株完全契合的风险以及存在与其他毒株重组产生新毒株的可能性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一株IBDV致弱病毒株，该毒株不引起法氏囊损伤，又可以诱导产生高滴度的抗体，以及抵御强毒株的攻击并且对鸡只的发育没有任何影响。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一株致弱的传染性法氏囊病病毒，保藏名称：传染性法氏囊病病毒IBDV/1F，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：V201834，保藏日期：2018年7月3日。本专利技术还同时提供了上述致弱的传染性法氏囊病病毒的用途：用于制备疫苗，该病毒株不引起鸡的法氏囊损伤，又可以诱导产生高滴度的针对鸡传染性法氏囊病病毒的抗体。本专利技术还同时提供了上述致弱的传染性法氏囊病病毒的另一种用途：该疫苗能抵御强毒株的攻击，且对鸡只的发育没有影响。本专利技术的毒株IBDV/1F可以在其病毒蛋白VP1的C末端融合表达一个小分子标签Flag，与野生型毒株相比，在感染鸡源细胞DF-1时，利用Flag抗体可以检测到融合蛋白的存在，且在相同位置还可以检测到VP1的表达(图1)。与此同时，本专利技术对IBDV/1F的基因组进行抽提，经RT-PCR扩增与DNA测序发现，在vp1基因的3'端存在编码Flag标签的序列(图2)。将IBDV/1F和其亲本毒株IBDV/wt(104PFU)通过点眼的方式接种于2周龄的SPF鸡(5只/组，2只阴性对照)，隔离饲养2周后无鸡只死亡，收集各组鸡只的体重、法氏囊重量，结果可见，接种IBDV/wt的鸡只法氏囊发生了明显的萎缩，接种IBDV/1F的鸡只法氏囊除表面有少许点状出血外与阴性对照组相比无明显差异(图3)；通过比较各组间法氏囊与鸡只体重比值及法氏囊指数发现，接种IBDV/wt组鸡只的法氏囊发生了明显的萎缩而接种IBDV/1F组鸡只法氏囊无明显变化(图3a和3b)，并且接种IBDV/wt组的鸡只体重与接种IBDV/1F和阴性组相比也是显著下降；而且在各组法氏囊中通过Westernblotting也检测到了对应的病毒蛋白的存在。进一步，专利技术人又进行了IBDV免疫抑制实验，3周龄SPF鸡(接种前采集血液分离血清作为阴性血清)通过滴鼻点眼的方式分别接种IBDV/wt和IBDV/1F(每组5只，2×104TCID50/只)，阴性对照接种相同体积的DMEM，24小时后所有鸡只再通过滴鼻点眼的方式接种NDV(LaSota株，106EID50)，分别在NDV疫苗接种后7天和14天分别采集鸡只血液分析血清，测定血清中抗体的血凝抑制效价，结果显示接种IBDV/1F对于NDV疫苗的免疫没有影响，而接种IBDV/wt后显著抑制鸡体产生针对NDV的中和抗体(图5)。本专利技术的毒株IBDV/1F对临床分离而来的亲本毒株A片段的编码序列不做任何改变，完全保留了亲本毒株的免疫原性，仅在亲本毒株的B片段编码蛋白VP1的C末端融合表达一条8个氨基酸的Flag标签而得到的致弱毒株(上述内容可从图1中明确得知)，因此本专利技术相对于现有的致弱毒株而言，具有完全保留临床分离毒株免疫原性的技术优势。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1重组病毒IBDV/1F和野生型病毒IBDV/wt感染DF-1细胞时的Westernblotting检测；图2将重组病毒IBDV/1F的基因组抽提后进行RT-PCR扩增B片段部分，经测序证实在vp1基因的3'端存在Flag标签序列。图3接种IBDV/wt、B87、IBDV/1F与阴性鸡只(DMEM)法氏囊的外观；a为接种B87、IBDV/wt与阴性鸡只(DMEM)的法氏囊大小的对比；b为阴性鸡只(DMEM)与接种IBDV/1F、B87的法氏囊大小的对比；图4接种B87、IBDV/1F和阴性鸡只(DMEM)的体重(a)、囊重比(b)、囊指数(c)和法氏囊中对应病毒蛋白的检测(d)。图5接种IBDV/wt、B87与阴性鸡只(DMEM)血清中抗体滴度消长规律(a)，及接种21天后强毒攻击后鸡只生存曲线(b)。图6接种B87、IBDV/1F与阴性鸡只(DMEM)24小时后分别再接种NDV疫苗(LaSota株)7和14天后血清中血凝抑制抗体效价分析。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1、IBDV致弱毒株的获取：将临床分离的亲本毒株IBDV/wt(Genbank获取号：MF083701和MF083702)在鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞上扩繁后，抽提其基因组RNA构建IBDV反向遗传学操作系统。通过基因工程的方法将编码Flag标签的核苷酸序列融合到vp1基因的下游，将获得的质粒转染293T细胞进行IBDV拯救，转染72h之后的细胞上清在DF-1细胞上传代3次以后，反复冻融3次裂解细胞，离心去除细胞碎片，最终获得IBDV致弱毒株IBDV/1F。IBDV致弱毒株IBDV/1F进行了保藏，保藏信息如下：保藏名称：传染性法氏囊病病毒IBDV/1F，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：V201834，保藏日期：2018年7月3日。实验1、感染鸡胚成纤维细胞系DF-1铺于6孔板中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.致弱的传染性法氏囊病病毒，其特征是保藏名称：传染性法氏囊病病毒IBDV/1F，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：V201834，保藏日期：2018年7月3日。
【技术特征摘要】
1.致弱的传染性法氏囊病病毒，其特征是保藏名称：传染性法氏囊病病毒IBDV/1F，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：V201834，保藏日期：2018年7月3日。2.如权利要求1所述的致弱的传...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶承金，刘合宾，王宇，陈绵绵，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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