包含NS1和NS2基因迁移的重组呼吸道合胞病毒株制造技术

本文报道了具有减毒表型的新型重组呼吸道合胞病毒(RSV)，其中RSV基因组中NS1和/或NS2基因的天然位置被迁移到更高的位置，即位于更远离启动子的位置。基因位置的变化可以与其他基因座的突变组合存在，以达到所需的减毒和免疫原性水平。本文描述的重组RSV株适合用作减毒活RSV疫苗。还提供了能够编码所述病毒的多核苷酸序列，以及产生和使用该病毒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含NS1和NS2基因迁移的重组呼吸道合胞病毒株相关申请本申请要求保护2015年12月11日提交的美国临时申请号62/266,206的优先权，其以其整体通过引用并入。领域本文公开的主题涉及呼吸道合胞病毒(RSV)及其适合用作疫苗的减毒突变株。背景人类呼吸道合胞病毒(RSV)在生命早期几乎感染了全世界每个人，并导致相当大的死亡率和发病率。仅在美国，RSV每年就有75,000-125,000例住院治疗，保守估计表明RSV在全世界每年导致6400万儿童感染和160,000或更多儿科死亡。RSV的另一个值得注意的特征是，婴儿期的严重感染经常在之后有持续的气道功能障碍，包括气道反应性的倾向，其在某些个体中持续多年并且可以延及青春期及以后。RSV感染加剧哮喘，并可能与哮喘开始有关。RSV是副粘病毒科的成员，因此是包膜病毒，其在细胞质中复制并通过在宿主细胞质膜上出芽而成熟。RSV的基因组是15.2千碱基的RNA的单个、负义链，其通过顺序终止-起始机制由病毒聚合酶转录成10个mRNA，所述终止-起始机制在基因组的3'末端处的单个病毒启动子处起始。每个mRNA编码单个主要蛋白质，除了M2mRNA具有两个重叠的开放阅读框(ORF)，其编码两个独立的蛋白质M2-1和M2-2。11种RSV蛋白为：RNA结合核蛋白(N)，磷蛋白(P)，大聚合酶蛋白(L)，附着糖蛋白(G)，融合蛋白(F)，小疏水性(SH)表面糖蛋白，内部基质蛋白(M)，两种非结构蛋白NS1和NS2，以及M2-1和M2-2蛋白。RSV基因顺序为：3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L。每个基因的侧翼都是称为基因-起始(GS)信号的短保守转录信号以及基因末端(GE)信号，所述基因-起始(GS)信号存在于每个基因的上游末端，并参与启动相应基因的转录，所述基因末端(GE)信号存在于每个基因的下游末端并参与指导polyA尾的合成，然后释放mRNA。转录起始于3'末端的单个启动子并顺序进行。RSV疫苗的开发自1960年代以来一直在进行中，但由于许多因素而变得复杂。例如，已经显示用灭活的RSV免疫未经历RSV的婴儿在随后的天然RSV感染中引发增强的疾病，并且在实验动物中的研究表明疾病增强也与纯化的RSV亚单位疫苗相关。免疫保护的另一个障碍是RSV在呼吸道腔的表面细胞中复制并引起疾病，其中免疫保护具有降低的有效性。因此，RSV感染的免疫控制是低效的并且通常是不完全的，并且RSV疫苗尽可能具有免疫原性是重要的。RSV疫苗的另一个障碍是保护性免疫应答的大小与病毒复制(和抗原产生)的程度大致成比例。因此，制备活疫苗所必需的RSV的减弱通常伴随着复制和抗原合成的减少，以及免疫原性的伴随性降低，因此鉴定耐受性良好以及具有令人满意的免疫原性的复制水平是有益的。另一个障碍是RSV在细胞培养中仅生长到适度的滴度，并且通常存在于难以纯化的长丝中。RSV在处理过程中很容易失去感染性。另一个障碍是难以鉴别和开发减毒突变。适当的突变必须在体内是减毒的，但对体外复制应该是最低限制的，因为这对于有效的疫苗生产是优选的。另一个障碍是RNA病毒特有的遗传不稳定性，其中减毒突变可以转变为野生型(wt)分配或赋予非减毒表型的替代分配。对于点突变，不稳定性和去减毒特别成问题。综合考虑这些因素，需要在体外有效复制，具有最大免疫原性，令人满意地减毒并且难以去减毒的活减毒RSV株。概述本文报道的是具有减毒表型的新型重组RSV，其中RSV基因组或反基因组中NS1和/或NS2基因的位置迁移到更远离启动子的位置。基因位置的变化可以与其他基因座的突变组合存在，以达到所需的减毒和免疫原性水平。本文描述的重组RSV毒株适合用作减毒活RSV疫苗。在一些实施方案中，提供了通过对RSV基因组的一种或多种修饰而减毒的重组RSV。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰包括NS1基因和NS2基因分别从RSV基因组的基因位置1和2迁移到基因位置7和8。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰包括NS1和NS2基因分别从重组RSV基因组的基因位置1和2(天然RSV基因组的位置)迁移至基因位置9和10。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰包括NS1基因向高于位置1的基因位置的迁移(例如，至基因位置7或9)。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰包括NS2基因向高于位置2的基因位置的迁移。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰包括NS1基因向高于位置1的基因位置的迁移，和NS2基因向高于位置2的基因位置的迁移。除了迁移NS1基因和/或NS2基因的基因位置的修饰之外，重组RSV的基因组可以包含进一步的修饰以增加或减少病毒减毒或重组病毒的其他性质，如全部或部分NS1、NS2基因和/或M2-2基因的缺失。在一些实施方案中，RSV基因组包括如上所述的一种或多种修饰，并且包含对应于与SEQIDNO:2(6120/NS12FM2)、SEQIDNO:4(6120/NS12Ltr)、SEQIDNO:6(6120/NS12FM2/ΔNS2)或SEQIDNO:8(6120/NS12Ltr/ΔNS2)至少90％、至少95％和/或至少99％相同的正义序列的核苷酸序列。例如，RSV基因组可包含对应于SEQIDNO:2(6120/NS12FM2)、SEQIDNO:4(6120/NS12Ltr)、SEQIDNO:6(6120/NS12FM2/ΔNS2)或SEQIDNO:8(6120/NS12Ltr/ΔNS2)所代表的正义序列的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，RSV基因组还包括报告基因，如编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因。在一些实施方案中，RSV基因组包括如上所述的一种或多种修饰和报告基因，并且包含对应于SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的正义序列的核苷酸序列，或对应于与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7至少90％、至少95％和/或至少99％相同的正义序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组RSV表现出下述一项或多项：(a)与具有基因位置1的NS1基因和基因位置2的NS2基因的RSV相比，NS1基因和/或NS2基因的表达减少；(b)与具有基因位置1的NS1基因和基因位置2的NS2基因的RSV相比，NS1基因和/或NS2基因的转录减少；和/或(c)与具有基因位置1的NS1基因和基因位置2的NS2基因的RSV相比，对宿主干扰素应答的抑制减少。在一些实施方案中，重组RSV对能够响应病毒感染产生干扰素的培养细胞中的限制越来越敏感。在一些实施方案中，重组RSV在不能响应病毒感染产生干扰素的培养细胞中保持复制效率。本文公开的重组RSV的实施方案可以是亚型ARSV或亚型BRSV。本文公开的重组RSV的实施方案是传染性、减毒和自我复制的。本文还公开了与本文公开的病毒的表达相关的方法和组合物。例如，公开了包括编码编码所述病毒的基因组或反基因组的核酸序列的分离的多核苷酸分子。还提供了包含所述重组RSV的药物组合物。所述组合物可进一步包含佐剂。还公开了通过向受试者施用免疫原性有效量的公开的重组RSV在受试者中引发免疫应答的方法。在一些实施方案中，受试者是人受试者，例如1至6个月龄，或1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.通过对呼吸道合胞病毒(RSV)基因组的一种或多种修饰减毒的重组呼吸道合胞病毒(RSV)，其中所述一种或多种修饰包括：(a)NS1基因和NS2基因分别从RSV基因组的基因位置1和2迁移到基因位置7和8；(b)NS1基因和NS2基因分别从RSV基因组的基因位置1和2迁移到基因位置9和10；(c)NS1基因迁移到高于位置1的基因位置；(d)NS2基因迁移到高于位置2的基因位置；或(e)(c)和(d)的组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.11 US 62/266,2061.通过对呼吸道合胞病毒(RSV)基因组的一种或多种修饰减毒的重组呼吸道合胞病毒(RSV)，其中所述一种或多种修饰包括：(a)NS1基因和NS2基因分别从RSV基因组的基因位置1和2迁移到基因位置7和8；(b)NS1基因和NS2基因分别从RSV基因组的基因位置1和2迁移到基因位置9和10；(c)NS1基因迁移到高于位置1的基因位置；(d)NS2基因迁移到高于位置2的基因位置；或(e)(c)和(d)的组合。2.权利要求1的重组RSV，其中所述一种或多种修饰包括(a)。3.权利要求1的重组RSV，其中所述一种或多种修饰包括(b)。4.权利要求1的重组RSV，其中所述一种或多种修饰包括(c)。5.权利要求1的重组RSV，其中所述一种或多种修饰包括(d)。6.权利要求1的重组RSV，其中所述一种或多种修饰包括(e)。7.权利要求4-6任一项的重组RSV，其中所述NS1基因迁移至基因位置7或9。8.上述权利要求任一项的重组RSV，其中所述RSV基因组进一步含有包括全部或部分所述NS1基因或所述NS2基因缺失的修饰。9.上述权利要求任一项的重组RSV，其中所述RSV基因组进一步含有包括全部或部分M2-2基因缺失的修饰。10.权利要求1-2或4-9任一项的重组RSV，其中所述RSV基因组包括所述一种或多种修饰，和对应于与SEQIDNO：2(6120/NS12FM2)至少90％、至少95％和/或至少99％相同的正义序列的核苷酸序列。11.权利要求10的重组RSV，其中所述RSV基因组包括由SEQIDNO：2(6120/NS12FM2)表示的正义序列。12.权利要求1或3-9任一项的重组RSV，其中所述RSV基因组包括所述一种或多种修饰，和对应于与SEQIDNO：4(6120/NS12Ltr)至少90％、至少95％和/或至少99％相同的正义序列的核苷酸序列。13.权利要求12的重组RSV，其中所述RSV基因组包括由SEQIDNO：4(6120/NS12Ltr)表示的正义序列。14.权利要求8的重组RSV，其中所述RSV基因组包括所述一种或多种修饰，和对应于与SEQIDNO:6(6120/NS12FM2/ΔNS2)或SEQIDNO:8(6120/NS12Ltr/ΔNS2)至少90％、至少95％和/或至少99％相同的正义序列的核苷酸序列。15.权利要求14的重组RSV，其中所述RSV基因组包括由SEQIDNO:6(6120/NS12FM2/ΔNS2)或SEQIDNO:8(6120/NS12Ltr/ΔNS2)表示的正义序列。16.权利要求1的重组RSV，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·L·柯林斯，T·C·麦卡蒂，
申请(专利权)人：美利坚合众国由健康及人类服务部部长代表，
类型：发明
国别省市：美国,US