一种A型赛内卡病毒病毒样颗粒及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种A型赛内卡病毒病毒样颗粒及其制备方法和用途。所述的A型赛内卡病毒病毒样颗粒是由A型赛内卡病毒的结构蛋白VP0、结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3组装而成，其中编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQ ID NO.1所示，编码结构蛋白VP1的基因序列为SEQ ID NO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术尝试将不同融合标签结合使用，以期提高目的蛋白的表达量和病毒样颗粒的组装效率，结果显示，在SUMO VP1基因的N端再次融合GST后所得重组载体pGST/VP1，与pSMK/VP0和pSMC/VP3组合共同转染的表达菌表达的蛋白可溶性最好，VLPs的组装率最高。本发明专利技术的提出为进一步推进病毒样颗粒疫苗的研究和应用，加速动物疫苗由传统灭活苗向基因工程苗转化提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种A型赛内卡病毒病毒样颗粒及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种A型赛内卡病毒病毒样颗粒及其制备方法和用途，属于农业科学畜牧兽医学

技术介绍
A型塞尼卡病毒(SenecavirusA，SVA)也称为塞尼卡谷病毒(SenecaValleyvirus，SVV)，属于小RNA病毒科塞尼卡病毒属。SVA基因组长约7.2kb，为无囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈典型的二十面体对称，直径27nm左右。2002年，美国一家公司在细胞培养物中偶然发现了SVA，SVA最初被认为是细胞培养物中的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清。2007年SVA被发现是引起加拿大发生的猪原发性水疱病(PIVD)的致病病原。在2014年，巴西出现几次严重的感染症状，并导致巨大经济损失，该病才逐渐被重视。现有研究已证实SVA感染后能引起各年龄段的猪发生水疱。2015年3月，该病首次在我国广东某猪场暴发，之后在其他省份也有该病发生的报道。尽快研发疫苗则成为防控该病大范围流行最迫切最有效的方法。病毒样颗粒(VLPs)疫苗是可以不动用活毒，但免疫原性与灭活病毒几乎相同的疫苗形式，它是不含病毒核酸的空壳结构，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，由于不含有病毒遗传物质，因此不具有感染性。从安全性和免疫效力方面来讲，它是一种最有可能替代传统灭活疫苗的生物形式。本专利技术利用原核表达系统获得塞内卡谷病毒的病毒样颗粒，并检测其免疫原型，为塞内卡谷病毒的防控提供首选疫苗形式。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种A型赛内卡病毒的病毒样颗粒及其制备方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：原核表达系统生产VLPs，其优势是费用低廉，蛋白产率高，容易满足大规模生产。鉴于此，本专利技术利用原核表达系统，通过不同融合标签的组合，实现SVA结构蛋白的高效可溶性表达，经纯化、切割融合肽，体外组装成VLPs，结果显示，不同标签的组合提高了VLPs的组装效率，所获得的VLPs具有良好的反应原性和免疫原性。具体的，本专利技术的一种A型赛内卡病毒病毒样颗粒，是由A型赛内卡病毒的结构蛋白VP0、结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3组装而成，其中编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQIDNO.1所示，编码结构蛋白VP1的基因序列为SEQIDNO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示。进一步的，本专利技术还提出了一种制备所述的A型赛内卡病毒病毒样颗粒方法，包括以下步骤：(1)构建含有编码A型赛内卡病毒结构蛋白VP0、结构蛋白VP1或结构蛋白VP3基因序列的重组质粒，其中编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQIDNO.1所示，编码结构蛋白VP1的基因序列为SEQIDNO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示；(2)A型赛内卡病毒结构蛋白VP0、结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3的表达和纯化；(3)A型赛内卡病毒病毒样颗粒的组装。在本专利技术的一个具体实施例中，制备所述的A型赛内卡病毒病毒样颗粒方法，包括以下步骤：(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA、pSMK和pSMC的构建：1)以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F与smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’，2)经NcoI和BamHI双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体命名为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因或氯霉素抗性基因，所得载体分别命名为pSMA和pSMC；(2)SVA结构蛋白基因重组表达载体的构建根据已公布的SVA序列，进行密码子优化并合成编码结构蛋白VP0、VP1和VP3的基因序列；以合成的基因为模板，用以下引物对分别扩增VP0，VP1以及VP3基因片段：VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGCAACGTTCAAACCACC3’VP0R：5’CGCGGATCCTCACTGTTCCTCATCGGTACC3’VP1F：5’GGTCTCTAGGTAGCACCGACAACGCGGAG3’VP1R：5’CGCGGATCCTCATTGCATCAGCATTTTCTG3’VP3F：5’GGTCTCTAGGTGGTCCGATTCCGACCGCG3’VP3R：5’CGCGGATCCTCAGTGAAAAACATAGCTCGG3’采用聚合酶链式反应方法，分别用引物VP0F/VP0R、VP1F/VP1R和VP3F/VP4R扩增获得编码结构蛋白VP0、VP1和VP3的基因片段，其中，编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQIDNO.1所示，编码结构蛋白VP1的基因序列为SEQIDNO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示；扩增获得的VP0、VP1和VP3基因片段分别经BsmBI/BamHI双酶切后插入经BsaI酶切处理的pSMK、pSMA或pSMC，所构建重组表达载体分别命名为pSMK/VP0、pSMA/VP1和pSMC/VP3，以pSMK/VP0、pSMA/VP1和pSMC/VP3为模板，分别用GSTF/VP0GSTR、GSTF/VP1GST和GSTF/VP3GSTR引物对扩增含有VP0、VP1或VP3的基因片段，分别经BamH/XhoI双酶切后插入经同样酶切处理的pGEX4T-1载体，所得重组载体分别命名为pGSTVP0、pGSTVP1和pGSTVP3，所用引物序列如下：GSTF:5’GGCAATGGATCCATGGGTCATCACCATCATCATCAC,VP0GSTR:5’GGTAATCTCGAGTTACTGTTCCTCATCGGTACCGG,VP1GSTR:5’GGCCGTCTCGAGTTATTGCATCAGCATTTTCTGC,VP3GSTR:5’GGCCTTCTCGAGTTAGTGAAAAACATAGCTCGGG。(3)SVA重组蛋白的表达、纯化1)重组蛋白的表达将步骤(2)获得的重组表达载体pSMK/VP0、pSMA/VP1、pSMC/VP3、pGSTVP0、pGSTVP1和pGSTVP3采用不同组合搭配共转化到表达菌BL21(DE3)，用卡那霉素、氨苄青霉素和氯霉素结合PCR方法筛选同时含有VP0、VP1和VP3基因的阳性克隆；挑选阳性克隆菌于LB培养基中37℃220rpm过夜培养，将上述菌液以1:100接种LB培养基，于37℃220rpm培养至菌液的OD600达0.8，以终浓度为0.01mMIPTG、25℃过夜诱导表达，随后以5000rpm、30min离心收集菌体沉淀，-20℃储存备用；2)表达蛋白纯化用冰浴的缓冲液A重悬步骤1)得到的菌体沉淀，超声破碎菌体细胞；12,000×g离心30min，取上清，弃沉淀，上清与Ni-NTAHis·BindResins混匀，4℃结合30min；用缓冲液A洗去非特异性结合的杂蛋白，用缓冲液B洗脱目的蛋白，-70℃保存；所述的缓冲液A含有20mMTris-HCl，500mMNaCl，5mMImidazol，pH＝8.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种A型赛内卡病毒病毒样颗粒，其特征在于所述的A型赛内卡病毒病毒样颗粒是由A型赛内卡病毒的结构蛋白VP0、结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3组装而成，其中编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQ ID NO.1所示，编码结构蛋白VP1的基因序列为SEQ ID NO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种A型赛内卡病毒病毒样颗粒，其特征在于所述的A型赛内卡病毒病毒样颗粒是由A型赛内卡病毒的结构蛋白VP0、结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3组装而成，其中编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQIDNO.1所示，编码结构蛋白VP1的基因序列为SEQIDNO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示。2.一种制备权利要求1所述的A型赛内卡病毒病毒样颗粒方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建含有编码A型赛内卡病毒结构蛋白VP0、结构蛋白VP1或结构蛋白VP3基因序列的重组质粒，其中编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQIDNO.1所示，编码结构蛋白VP1的基因序列为SEQIDNO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示；(2)A型赛内卡病毒结构蛋白VP0、结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3的表达和纯化；(3)A型赛内卡病毒病毒样颗粒的组装。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA、pSMK和pSMC的构建：1)以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F与smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’，2)经NcoI和BamHI双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体命名为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因或氯霉素抗性基因，所得载体分别命名为pSMA和pSMC；(2)SVA结构蛋白基因重组表达载体的构建根据已公布的SVA序列，进行密码子优化并合成编码结构蛋白VP0、VP1和VP3的基因序列；以合成的基因为模板，用以下引物对分别扩增VP0，VP1以及VP3基因片段：VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGCAACGTTCAAACCACC3’VP0R：5’CGCGGATCCTCACTGTTCCTCATCGGTACC3’VP1F：5’GGTCTCTAGGTAGCACCGACAACGCGGAG3’VP1R：5’CGCGGATCCTCATTGCATCAGCATTTTCTG3’VP3F：5’GGTCTCTAGGTGGTCCGATTCCGACCGCG3’VP3R：5’CGCGGATCCTCAGTGAAAAACATAGCTCGG3’采用聚合酶链式反应方法，分别用引物VP0F/VP0R、VP1F/VP1R和VP3F/VP4R扩增获得编码结构蛋白VP0、VP1和VP3的基因片段，其中，编码结构蛋白VP0的基因序列为SEQIDNO.1所示，编码结构蛋白VP1的基因序列为SEQIDNO.2所示，编码结构蛋白VP3的基因序列为SEQIDNO.3所示；扩增获得的VP0、VP1和VP3基因片段分别经BsmBI/BamHI双酶切后插入经BsaI酶切处理的pSMK、pSMA或pSMC，所构建重组表达载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧琛，孙世琪，韩世充，董虎，郭笑然，殷宏，罗建勋，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62