一种增强猪瘟脾淋弱毒疫苗效价的体外培养方法技术

本发明专利技术涉及一种猪瘟脾淋弱毒疫苗疫苗体外培养方法，步骤如下：（1）选兔；（2）生产用毒制备；（3）猪瘟脾淋苗制备。包括接种，半成品的收货，捣碎除杂，生物反应器培养，配苗分装，冻干几个步骤。本发明专利技术在传统的猪瘟脾淋苗生产过程中，通过增加生物反应器培养环节，让猪瘟病毒再次扩繁，来提高病毒含量。通过本发明专利技术生产出的脾淋苗比传统的脾淋苗相比，效价得到大幅提高，提升了疫苗品质，值得推广。

【技术实现步骤摘要】
一种增强猪瘟脾淋弱毒疫苗效价的体外培养方法
本专利技术属于兽用医药生物领域，具体涉及一种增强猪瘟脾淋弱毒疫苗效价的体外培养方法。
技术介绍
猪瘟是由猪瘟病毒引起的，是一种伴有高接触和高致死性的传染病，以出血和发热为主要特征。在我国被列为一类动物传染病。对于该病的预防，我国研制出的猪瘟兔化弱毒疫苗C株，用其接种的猪不产生脑炎和病毒血症病变，可以安全接种任何怀孕期母猪和哺乳仔，不影响受精率，不会引起死胎。猪该毒株生产出的疫苗有猪瘟兔化脾淋组织疫苗、细胞培养苗、乳兔组织苗等。猪瘟脾淋弱毒疫苗是目前对抗猪瘟病毒最有效的防御措施之一，因为其最好的保持了C株的遗传稳定性、免疫原性和安全性，受到广大养殖户的青睐。但同时存在一个问题，传统猪瘟脾淋苗疫苗制备工艺，产毒滴度较低，单位体积有效工作细胞量数较低，批次间稳定性低。因此，开发新的制备方法是提高病毒产量的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种增强猪瘟脾淋弱毒疫苗效价的体外培养方法，在传统的猪瘟脾淋苗生产过程中，通过增加生物反应器培养环节，让猪瘟病毒再次扩繁，来提高病毒含量，从而提升疫苗效价品质，降低大兔使用，不仅提高了动物福利，而且降低了生产成本。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案如下：一种可以增强猪瘟脾淋弱毒疫苗效价的体外培养方法。该方法步骤如下：（1）选兔：选取2-3kg健康的家兔，接种之前需测温观察3天，体温需符合要求。（2）生产用毒制备：将猪瘟兔化弱毒株（中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应）用灭菌生理盐水制成20-50倍稀释的乳剂，接种于兔耳静脉注射1ml。接种24小时候，每隔6-8小时测温一次，选择定型热反应兔，致死后无菌采取脾脏，作为生产用种毒。保存于-20℃。（3）猪瘟脾淋苗制备。具体步骤如下：1）接种：将生产毒种用猪瘟病毒专用保护剂制成20-50倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1mL；接种24小时候，每隔6-8小时测温一次。2）半成品的收获：选择定型热反应兔，在体温下降开始24h内致死，无菌采取脾脏和淋巴结，即得半成品。3）捣碎除杂：将新鲜采集的脾脏合淋巴结按每100g加1000ml-2000ml的专用营养液用匀浆机捣碎5分钟后，用脾淋苗组织分滤器过滤除杂。4）生物反应器培养：将过滤后的营养液液体移入生物反应器，并加入大兔血清，设定好参数。培养2-6小时。所述的大兔血清，其含量占所加营养液体积的8-12%。5）配苗及分装：在无菌操作下，取出混合液体，按每升混合液体加冻干保护剂6~9升充分搅匀后，按2~3ML/瓶定量分装。6）冻干：分装后迅速进行冷冻真空干燥，按《中国兽用生物制品规程》附录进行，需符合规定。7）成品检验：按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》的要求进行检测。所述的专用营养液为：每升营养液中含有精氨酸1g-5g、赖氨酸1g-5g、谷氨酸1g-5g、甘氨酸1g-5g，其余为细胞生长液（DMEM）。所述的冻干保护剂为：每升冻干保护剂中含有海藻糖10-40g，蔗糖10-50g，水解乳蛋白5-30g，水解明胶10-30g、脱脂奶粉30-50g，其余为注射用水。所述生物反应器为搅拌式生物反应器。设定参数为：温度35-38℃，溶氧40-80%，pH6.0-8.0，搅拌速度：5-30rmp。所述检验合格的生产用种毒必须按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》的要求进行鉴定；应符合规定。本专利技术的优点在于：本专利技术将判定为定型热的兔子无菌取脾脏和淋巴结后，经细胞破碎，加入到生物反应器继续培养2-6小时来扩繁。本专利技术比传统的脾淋苗相比，效价得到了进一步提高，提升了疫苗品质，值得推广。具体实施方式下述实施例仅对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1一种可以增强猪瘟脾淋弱毒疫苗效价的体外培养方法。该方法步骤如下：（1）选兔：选取3kg健康的家兔，接种之前需测温观察3天，体温需符合要求。（2）生产用毒制备：将猪瘟兔化弱毒株（中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应）用灭菌生理盐水制成40倍稀释的乳剂，接种于兔耳静脉注射1ml。接种24小时候，每隔7小时测温一次，选择定型热反应兔，致死后无菌采取脾脏，作为生产用种毒。保存于-20℃。（3）猪瘟脾淋苗制备。具体步骤如下：接种：将生产毒种用猪瘟病毒专用保护剂制成40倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1mL；接种24小时候，每隔7小时测温一次。进一步，半成品的收获和：选择定型热反应兔，在体温下降开始24h内致死，无菌采取脾脏和淋巴结，即得半成品。进一步，捣碎除杂：将新鲜采集的脾脏合淋巴结按每100g加2000ml的专用营养液用匀浆机捣碎5分钟后，用脾淋苗组织分滤器过滤除杂。进一步，生物反应器培养：将过滤后的液体移入生物反应器，并加入大兔血清，设定好参数。培养4小时。进一步，配苗及分装：在无菌操作下，取出混合液体，按每升混合液体加冻干保护剂7升充分搅匀后按2.5ML/瓶定量分装。进一步，冻干：分装后迅速进行冷冻真空干燥，按《中国兽用生物制品规程》附录进行，需符合规定。进一步，成品检验：按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》的要求进行检测。所述的专用营养液为：每升营养液中含有精氨酸2g、赖氨酸2g、谷氨酸2g、甘氨酸3g，其余为细胞生长液（DMEM）。所述的冻干保护剂为：每升冻干保护剂中含有海藻糖30g，蔗糖30g，水解乳蛋白10g，水解明胶20g、脱脂奶粉40g，其余为注射用水。所述的生物放映器设定参数为：温度37℃，溶氧80%，PH6.5，搅拌速度：30rmp。所述的大兔血清，其含量占所加营养液体积的12%。所述检验合格的生产用种毒必须按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》的要求进行鉴定；应符合规定。实施例2一种可以增强猪瘟脾淋弱毒疫苗效价的体外培养方法。该方法步骤如下：（1）选兔：选取2kg健康的家兔，接种之前需测温观察3天，体温需符合要求。（2）生产用毒制备：将猪瘟兔化弱毒株（中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应）用灭菌生理盐水制成20倍稀释的乳剂，接种于兔耳静脉注射1ml。接种24小时候，每隔6小时测温一次，选择定型热反应兔，致死无菌采取脾脏，作为生产用种毒。保存于-20℃。（3）猪瘟脾淋苗制备。具体步骤如下：接种：将生产毒种用猪瘟病毒专用保护剂制成20倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1mL；接种24小时候，每隔6小时测温一次。进一步，半成品的收获和：选择定型热反应兔，在体温下降开始24h内致死，无菌采取脾脏和淋巴结，即得半成品。进一步，捣碎除杂：将新鲜采集的脾脏合淋巴结按每100g加1500ml的专用营养液用匀浆机捣碎5分钟后，用脾淋苗组织分滤器过滤除杂。进一步，生物反应器培养：将过滤后的液体移入生物反应器，并加入大兔血清，设定好参数。培养2小时。进一步，配苗及分装：在无菌操作下，取出混合液体，按每升混合液体加冻干保护剂9升充分搅匀后按2.5ML/瓶定量分装。进一步，冻干：分装后迅速进行冷冻真空干燥，按《中国兽用生物制品规程》附录进行，需符合规定。进一步，成品检验：按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》的要求进行检测。所述的专用营养液为：每升营养液中含有精氨酸1g、赖氨酸1g、谷氨酸1g、甘氨酸1g，其余为细胞生长液（DMEM）。所述的冻干保护剂为：每升冻干保护剂中含有海藻糖10g，蔗糖10g，水解乳蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强猪瘟脾淋弱毒疫苗效价的体外培养方法，其特征在于：该方法步骤如下：（1） 选兔：选取2‑3kg健康的家兔，接种之前测温观察3天，体温介于38℃‑39.7℃之间；（2）生产用种毒制备：将猪瘟兔化弱毒株用灭菌生理盐水制成20‑50倍稀释的乳剂，接种于兔耳静脉注射1ml，接种24小时后，每隔6‑8小时测温一次，选择定型热反应兔，致死后无菌采取脾脏，作为生产用种毒，保存于‑20℃；（3） 猪瘟脾淋苗制备：A 接种：将生产毒种用灭菌生理盐水制成20‑50倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1mL；接种24小时后，每隔6‑8小时测温一次；B 半成品的收获：选择定型热反应大兔，致死后无菌采取脾脏和淋巴结，即得半成品；C 捣碎除杂：将新鲜采集的脾脏和淋巴结按每100g加1000ml‑2000ml的专用营养液用匀浆机捣碎5分钟后，用脾淋苗组织分滤器过滤除杂；D生物反应器培养：将过滤后的专用营养液液体移入生物反应器，并加入大兔血清，设定好参数；培养2‑6小时；E 配苗及分装：在无菌操作下，取出混合液体，按每升混合液体加冻干保护剂6~9升充分搅匀后，按2~3ML/瓶定量分装；F冻干：分装后迅速进行冷冻真空干燥；G成品检验：按照要求进行检测。...

【技术特征摘要】
1.一种增强猪瘟脾淋弱毒疫苗效价的体外培养方法，其特征在于：该方法步骤如下：（1）选兔：选取2-3kg健康的家兔，接种之前测温观察3天，体温介于38℃-39.7℃之间；（2）生产用种毒制备：将猪瘟兔化弱毒株用灭菌生理盐水制成20-50倍稀释的乳剂，接种于兔耳静脉注射1ml，接种24小时后，每隔6-8小时测温一次，选择定型热反应兔，致死后无菌采取脾脏，作为生产用种毒，保存于-20℃；（3）猪瘟脾淋苗制备：A接种：将生产毒种用灭菌生理盐水制成20-50倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1mL；接种24小时后，每隔6-8小时测温一次；B半成品的收获：选择定型热反应大兔，致死后无菌采取脾脏和淋巴结，即得半成品；C捣碎除杂：将新鲜采集的脾脏和淋巴结按每100g加1000ml-2000ml的专用营养液用匀浆机捣碎5分钟后，用脾淋苗组织分滤器过滤除杂；D生物反应器培养：将过滤后的专用营养液液体移入生物反应器，并加入大兔血清，设定好参数；培养2-6小时；E配苗及分装：在无菌操作下，取出混合液体，按每升混合液体加冻干保护剂6~9升充分搅匀后，按2~3ML/瓶定量分装；F冻干：分...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘幼英，刘小龙，池宗棋，陈建，瞿晓斌，范江钢，
申请(专利权)人：派生特福州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35