The invention discloses a method for constructing Staphylococcus lactis co-fermenting glucose and xylose to produce D - lactic acid, which belongs to the field of genetic engineering. The construction steps include the integration of isoxylose isomerase, xylose kinase, transketolase and transaldolase coding genes on the genome of Pediococcus acidilactici ZP26 (CGMCC NO. 8665), the knockout of phosphoketolase coding genes to block the production of acetic acid by-product, and the integration of isoxylose isomerase, xylose kinase, transketolase and transaldolase coding genes on the genome of Pediococcus acidilactici ZP26 (CGMCC NO. 86 Through adaptive domestication strategy, the co-fermentation ability of engineering strains for glucose and xylose was significantly improved. For the first time, the xylose metabolic pathway of S. lactis was successfully constructed, and an engineering strain was obtained, named P. acidilactici ZY15 and its preservation number was CGMCC NO. 13612, for the production of optical pure D lactic acid by co-fermentation of glucose and xylose.
【技术实现步骤摘要】
一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法
本专利技术属于基因工程领域,特别涉及一种利用热敏型敲除系统,基于同源重组原理的共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法。
技术介绍
D-乳酸是一种重要的工业化学品,它广泛运用于食品、医药、皮革以及纺织业。近年来,以D-乳酸为前体生产生物可降解性塑料聚乳酸,使得光学纯D-乳酸的需求大大提升。但是,目前世界D-乳酸产量的90%都是由淀粉类原料进行发酵得到的,这就存在“与人争粮”问题。寻找更加便宜的原料进行D-乳酸生产将有助于减少粮食危机。木质纤维素原料是一种价格低廉、来源广泛的可再生生物质能源,利用含量丰富的木质纤维素原料生产D-乳酸是一种非常有前途的选择,并且已经有大量研究开始利用木材、农业废弃物等木质纤维素原料进行D-乳酸生产。木质纤维素的主要组成部分是纤维素(30-60%干重)、半纤维素(20-40%)和木质素(15-25%)。其中纤维素来源的葡萄糖可以被微生物利用进行生物基化学品的生产。半纤维来源的木糖约占木质纤维素来源总糖含量的约30%,然而绝大部分生物炼制菌株都不能利用木糖,这限制了木质纤维素原料进行高浓度生物基化学品生产。本实验室先前工作中,筛选得到一株乳酸片球菌P.acidilaticiDQ2,该菌可以很好的适应木质纤维素体系,并可以利用玉米秸秆原料产生103g/L的乳酸。之后通过基因工程改造敲除了乳酸片球菌P.acidilaticiDQ2基因组上L-乳酸脱氢酶编码基因ldh,得到的工程菌株P.acidilaticiZP26可以利用25%(w/w)固含量的玉米秸秆原料产生77.7 ...
【技术保护点】
1.一种共发酵葡萄糖和木糖生产D‑乳酸的乳酸片球菌构建方法,步骤包括:(1)启动子与xylAB基因簇的优化:木糖异构酶(xylA)和木酮糖激酶(xylB)的编码基因是进行木糖代谢的两个最主要基因,xylA和xylB基因的表达水平直接决定了木糖的代谢速率,因此通过优化不同启动子和不同来源的xylAB对xylAB的基因表达水平进行了优化。(2)xylAB基因组整合表达:将步骤(1)中得到的最优的xylAB表达框,通过同源重组整合至乳酸片球菌ZP26基因组上。(3)磷酸转酮酶编码基因pkt的敲除:在步骤(2)得到的菌株基础上,通过同源重组敲除了磷酸转酮酶路径的关键基因pkt,以减少副产物乙酸生成。(4)转酮醇酶和转醛醇酶编码基因的整合:在步骤(3)得到的菌株基础上,通过同源重组将异源的转酮醇酶基因(tkt)和转醛醇酶基因(tal)整合至其基因组上。(5)适应性驯化:将步骤(4)得到的菌株,在木糖为唯一碳源的培养基中进行适应性驯化。
【技术特征摘要】
1.一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法,步骤包括:(1)启动子与xylAB基因簇的优化:木糖异构酶(xylA)和木酮糖激酶(xylB)的编码基因是进行木糖代谢的两个最主要基因,xylA和xylB基因的表达水平直接决定了木糖的代谢速率,因此通过优化不同启动子和不同来源的xylAB对xylAB的基因表达水平进行了优化。(2)xylAB基因组整合表达:将步骤(1)中得到的最优的xylAB表达框,通过同源重组整合至乳酸片球菌ZP26基因组上。(3)磷酸转酮酶编码基因pkt的敲除:在步骤(2)得到的菌株基础上,通过同源重组敲除了磷酸转酮酶路径的关键基因pkt,以减少副产物乙酸生成。(4)转酮醇酶和转醛醇酶编码基因的整合:在步骤(3)得到的菌株基础上,通过同源重组将异源的转酮醇酶基因(tkt)和转醛醇酶基因(tal)整合至其基因组上。(5)适应性驯化:将步骤(4)得到的菌株,在木糖为唯一碳源的培养基中进行适应性驯化。2.根据权利要求书1,其特征在于,步骤(1)中使用的表达质粒为pMG36e。3.根据权利要求书1,其特征在于,步骤(1)所述的启动子为PldhD和Pldh,分别是乳酸片球菌ZP26基因组上D-乳酸脱氢酶编码基因(ldhD)和L-乳酸脱氢酶编码基因(ldh)起始密码子上游约300bp的启动子序列。4.根据权利要求书1,其特征在于,步骤(1)所述的xylAB基因簇分别为:xylAB_2911,xylAB_3089和xylAB_pp,其中xylAB_2911和xylAB_3089来源于乳酸片球菌DSM20284,xylAB_pp来源于戊糖片球菌ATCC25745。5.根据权利要求书1,其特征在于,步骤(1)优化得到的表达框为PldhD_xylAB_2911。6.根据权利要求书1,其特征在于,步骤(2)、(3)和(4)中使用的敲除和整合质粒均为热敏型敲除质粒pSET4E。7.根据权利要求书1,其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员:鲍杰,邱忠洋,高秋强,
申请(专利权)人:华东理工大学,
类型:发明
国别省市:上海,31
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