细胞色素CYP3A7酶的特异性探针反应及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种细胞色素CYP3A7酶的特异性探针反应及其应用。该探针反应为去氧胆酸的19‑羟化反应，去氧胆酸是探针反应的底物，19‑羟基去氧胆酸是探针反应的产物。以去氧胆酸作为底物，通过测定单位时间内19‑羟基去氧胆酸的生成速率，作为细胞色素CYP3A7酶活性的评价指标。本发明专利技术可实现不同来源的生物样本中细胞色素CYP3A7酶活性的定量评估和抑制剂的筛选。

【技术实现步骤摘要】
细胞色素CYP3A7酶的特异性探针反应及其应用
本专利技术属医药
，具体涉及一种细胞色素CYP3A7酶的特异性探针反应及其应用。
技术介绍
细胞色素P450酶(CytochromeP450,CYPs)为一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，广泛参与内源性甾体物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢转化和清除。根据氨基酸序列的同源程度，CYPs成员依次分为家族、亚家族和亚型酶三级。CYP1A、CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D、CYP2E和CYP3A等亚家族是人体内主要的I相药物代谢酶，它们主要表达在肝脏，参与了约75%的上市药物的代谢清除。其中，CYP3A亚家族最为重要，在肝脏和肠道的表达量分别占CYP总量的40%和80%，参与了约46%的上市药物的代谢清除(NatRevDrugDiscov.2005,4(10):825-833)。受遗传因素、非遗传因素和药物相互作用等因素的影响，CYP3A酶的表达量、催化功能和代谢贡献率存在巨大的个体差异，由此导致不同个体使用相同的药物治疗方案后体内药物浓度水平存在巨大的差异，从而产生显著不同的安全性和有效性结局(AnnuRevPharmacolToxicol.1998,38:389-430)。因此，设计灵敏有效的CYP3A酶活性检测方法是极为迫切的，这对药物开发阶段的药物筛选和药物应用阶段的个体化治疗均具有重要的意义。人体主要表达三种CYP3A亚型酶，分别为CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7，它们的蛋白质序列的一致性超过82%，却呈现出显著不同的底物识别性、代谢反应催化活性和区域选择性(AnnuRevPharmacolToxicol.1999,39:1-17)。CYP3A4和CYP3A5是成年人体内发挥药物代谢功能的主要CYP3A亚型酶，它们具有高度相似的底物识别性。CYP3A7是新生儿和婴幼儿的主要CYP3A亚型酶：在新生儿期（出生后1周内）CYP3A7约占CYP总表达量的30%，此时CYP3A4的表达量远低于成年人水平；在之后的婴儿期和幼儿期，CYP3A7的表达逐渐下调，而CYP3A4的表达逐渐上调，直到青少年期才发育到成年人的水平(ClinPharmacokinet.1999,37(6):485-505)。成年人的CYP3A7表达量通常很低，仅CYP3A7*1C单核苷酸突变型（SNP）的基因携带者具有表达。有研究表明，CYP3A7*1C基因与多囊卵巢综合症的发病有关(JClinEndocrinolMetab.2008,93:2909-12)，与慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌和肺癌化疗失败的结局有关(CancerRes.2016,76(6):1485-93)，而且与孕期胎儿发育程度有关(HumMolGenet.2018,27(4):742-56)。因此，设计灵敏有效的CYP3A7酶活性检测方法，不仅对于儿科药物的开发和应用具有重要的意义，而且对于CYP3A7有关的代谢性疾病的辅助诊断、孕期胎儿发育和及肿瘤患者化疗预后的评估也潜在重要价值。CYP3A酶活性的体外评价体系主要包括重组酶、哺乳动物的亚细胞组分、新鲜分离的肝细胞、肝切片、肝灌流等(ToxicolInVitro.2006,20(2):135-53)，其中已商品化的重组细胞色素CYP3A7酶主要来自于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌建立的克隆表达体系，而亚细胞组分主要包括微粒体、细胞浆及S9成分。采用这些标准化的评价体系，结合相应的辅因子（如NADPH等）和孵育条件，可通过检测探针反应的底物代谢清除速率或产物生成速率，对上述各种体系中表达的CYP3A7酶活性进行表征。目前，主要采用特异性探针底物及其探针反应来测定CYP3A酶的活性(DrugMetabRev.2007,39(4):699-721)。已经发现或已在体外和体内研究中广泛应用的探针均为CYP3A4和/或CYP3A5的特异性的，如咪达唑仑1'-羟化反应(Midazolam1'-hydroxylation)、睾酮6beta-羟化反应(Testosterone6beta-hydroxylation)、戈米辛A的8-羟化反应(GomisinA8-hydroxylation)、皮质醇6beta-羟化反应(Cortisol6beta-hydroxylation)和胆固醇4beta-羟化(Cholesterol4beta-hydroxylation)等。有研究认为脱氢表雄酮的16-羟化(Dehydroepiandrosterone16alpha-hydroxylation)和睾酮的2alpha-羟化反应(Testosterone2alpha-hydroxylation)可以作为CYP3A7的特异性探针反应，但重组酶测试结果显示这两种探针反应的特异性远未达到实际应用的要求：CYP3A7对脱氢表雄酮16alpha-羟化的催化活性仅为CYP3A4的3.0倍(JPharmacolExpTher.2003,307(2):573-82)，CYP3A7对睾酮的2alpha-羟化的催化活性仅为CYP3A4的2.5倍(JPharmacolExpTher.2005,314(2):626-635)。综上所述，目前尚无任何用于CYP3A7活性测定的特异性探针反应，而CYP3A7活性测定技术的关键在于选择高特异性的探针反应。去氧胆酸(deoxycholicacid,3alpha,12alpha-dihydroxy-5beta-cholan-24-oicacid)是一种甾体类化合物，去氧胆酸的19-羟化反应是本专利技术首次披露的一种探针反应。Kurosawa等曾经推测19-羟基去氧胆酸可能是去氧胆酸的羟化产物(ChemPharmBull.1995,43(9):1551-1557)，该研究合成了19-羟基去氧胆酸(3alpha,12alpha,19-trihydroxy-5beta-cholan-24-oicacid)，但是并未观测到去氧胆酸的19-羟化反应。迄今本专利技术申请为止，并未有任何研究观测到去氧胆酸的19-羟化反应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种细胞色素CYP3A7酶的特异性探针反应及其应用，具体为去氧胆酸的19-羟化反应是CYP3A7的高特异性探针反应，可用于定量测定不同来源生物样本中CYP3A7酶的活性。与目前文献报道潜在探针反应（脱氢表雄酮的16-羟化反应和睾酮的2alpha-羟化反应）相比，包括CYP3A4、CYP3A5在内的其它已知CYP亚型酶对去氧胆酸-19羟化反应完全没有催化活性，该反应可高度特异性地表征CYP3A7酶的活性。本专利技术具体提供了一种细胞色素CYP3A7酶的新型特异性探针反应，其特征在于：该探针反应的底物为去氧胆酸(deoxycholicacid)，其结构如式(1)所示；该探针反应的产物为19-羟基去氧胆酸(19-hydroxyldeoxycholicacid)，其结构如式(2)所示。本专利技术还提供了所述特异性探针反应用于定量测定体外生物样本中CYP3A7酶活性的方法，采用去氧胆酸作为探针反应的底物，通过定量检测单位时间内19-羟基去氧胆酸的生成量来测定不同来源生物样品及细胞中CYP3A7酶的活性，具体测定方法为：—本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞色素CYP3A7酶的特异性探针反应及其应用，其特征在于：所诉探针反应的底物为去氧胆酸，结构式如式（1）所示，所述探针反应的产物为19‑羟基去氧胆酸，结构式如式（2）所示。

【技术特征摘要】
1.一种细胞色素CYP3A7酶的特异性探针反应及其应用，其特征在于：所诉探针反应的底物为去氧胆酸，结构式如式（1）所示，所述探针反应的产物为19-羟基去氧胆酸，结构式如式（2）所示。2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：采用所述细胞色素CYP3A7酶的特异性探针反应在体外检测生物样本中细胞色素CYP3A7酶的活性。3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，测定方法及条件为...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰轲，徐亮，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51