柴胡皂苷元A和D的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于医药领域，具体为酶水解柴胡皂苷制备柴胡皂苷元A和柴胡皂苷元D的工艺。柴胡皂苷元A和D的具体制备步骤包括：(1)柴胡总皂苷溶液中加入复合植物水解酶，在pH＝4.5～6的条件下，40～60℃反应15～30小时；(2)柴胡皂苷酶解液用有机溶剂萃取，合并萃取液并浓缩干燥，取固体；(3)固体溶解于醇，制备液相色谱法分离，得到柴胡皂苷元A和柴胡皂苷元D。该方法工艺稳定，产率提高；酶水解转化率高，产物纯度可达98％以上。柴胡皂苷元A和D对四种亚型的人乳腺癌细胞系均有抑制作用，可用于制备治疗乳腺癌的药物。

【技术实现步骤摘要】
柴胡皂苷元A和D的制备方法及应用
本专利技术属于医药领域，具体是天然产物的制备及其应用。
技术介绍
乳腺癌是威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤，其发病率高居女性恶性肿瘤发病率之首(每十万人中约43.3人罹患乳腺癌)。统计显示，每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2％和9.6％(L.Fan,K.Strasser-Weippl,J.JLi,etal.BreastcancerinChina.LancetOncol.2014:15(7):e279-289.)。乳腺癌易产生化疗耐受，特别是多药耐受的问题一直是限制乳腺癌综合治疗疗效的瓶颈，严重降低了已发生乳腺癌转移患者的生存率和生存期。据统计，90％以上的转移性乳腺癌存在着不同程度的化疗耐受，一线化疗药物的首次有效率约为30-70％，且有效作用期仅持续6-10个月，但化疗药物依然是临床治疗乳腺癌的主力军(S.Braga.ClinicalandMolecularMethodsinDrugDevelopment:NeoadjuvantSystemicTherapyinBreastCancerasaModel.MethodsMolBiol,2016,1395:251-280.C.Twelves,M.Jove,A.Gombos,etal.Cytotoxicchemotherapy:Stillthemainstayofclinicalpracticeforallsubtypesmetastaticbreastcancer.CritRevOncolHematol.2016,100:74-87.H.JBowles,K.LClarke.)。近年来，临床用于转移性乳腺癌的靶向药物不断推陈出新，如2015年美国FDA批准的细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)抑制剂Palbociclib成功上市，用于治疗HR+/HER2-(LuminalA型)绝经后晚期乳腺癌，但存在中性粒细胞缺乏、白血球减少、疲劳以及肺栓塞等副作用，并且价格昂贵。对于转移能力很强的HR-/PR-/HER2-(basal-like型)乳腺癌，2016年美国临床肿瘤学会年会报道：多种药物已处于III期临床研究阶段，至今仍未有药物上市。化疗药物的耐受性以及靶向药物的局限性使得研究者们更加重视从天然活性产物中发现抗肿瘤前药，研发疗效强、毒副作用低的药物，以应对具有较强转移能力的恶性肿瘤。如以长春新碱、紫杉醇、鬼臼毒素、丹参内酯、姜黄素、桦木酸等天然活性成分为前药开发的抗肿瘤药物已广泛用于白血病、乳腺癌、前列腺癌和肺癌的临床治疗，为癌症患者带来治愈或者延长生存期的希望(HItokawa,S.LMorris-Natschke,T.Akiyama,etal.Plant-derivednaturalproductresearchaimedatnewdrugdiscovery.JNat.Med.2008,62(3):263-280.)。本专利技术所涉及的两种天然成分柴胡皂苷元A和D来源于植物药柴胡。柴胡始载于《神农本草经》，为伞形科柴胡属北柴胡(BupleurumchinenseDC.)和狭叶柴胡(BupleurumscozonerifoliumWilld.)的干燥根，属于中药辅助治疗乳腺癌方剂中疏肝健脾类常用药物，而针对柴胡中抗乳腺癌有效成分的研究和报道非常有限。2003年台湾学者发现柴胡皂苷A对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(basal-like型)和MCF-7(LuminalA型)的生存与增殖有抑制作用；2015年Shin等发现柴胡皂苷A和D能够抑制骨转移乳腺癌细胞的活性和迁移能力(J.CChen,N.WChang,J.GChung,etal.Saikosaponin-AInducesApoptoticMechanisminHumanBreastMDA-MB-231andMCF-7CancerCells.AmJChinMed.2003,31(3):363-377.J.EShin,H.JKim,K.RKim,etal.TypeIsaikosaponinsaanddinhibitosteoclastogenesisinbonemarrow-derivedmacrophagesandosteolyticactivityofmetastaticbreastcancercells.EvidBasedComplementAlternatMed.2015,2015:582437.)。然而，柴胡皂苷A和D的溶血毒性以及肝脏毒性不可忽视。柴胡皂苷元A、D分别为柴胡皂苷A、D的胃肠道代谢产物，此两种苷元是否具有更强的乳腺癌细胞毒性和较低的溶血毒性及肝脏毒性值得深入研究。柴胡皂苷元A和D在柴胡植物中含量较低，已有从北柴胡中提取柴胡皂苷元A、D的报道，但提取步骤繁琐、化合物产量较低，仅适用于柴胡皂苷元A、D的鉴定试验(D.QLi,L.Zhou,D.Wang,etal.NeuroprotectiveoleananetriterpenesfromtherootsofBupleurumchinense.Bioorg.Med.Chem.Let.2016,26(6):1594–1598.)；而通过盐酸水解柴胡皂苷A的方法制备柴胡皂苷元A，造价相对较高，不适宜大量制备(R.Tundis,M.Bonesi,B.Deguin,etal.CytotoxicactivityandinhibitoryeffectonnitricoxideproductionoftriterpenesaponinsfromtherootsofPhysospermumverticillatum(Waldst&Kit)(Apiaceae).Bioorg.Med.Chem.2009,17(13):4542-4547)。因此需要开发一种新的低成本、便捷的制备方法，适合柴胡皂苷A和D的大量制备。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种酶水解制备柴胡皂苷元A和D的新方法。柴胡皂苷元A(SaikogeninA，SGA)、柴胡皂苷元D(SaikogeninD，SGD)的结构式分别如式I、II所示：本专利技术技术方案为，柴胡皂苷元A和D的制备方法，步骤包括：(1)柴胡总皂苷溶液中加入复合植物水解酶，在pH＝4.5～6的条件下，40～60℃反应15～30小时；所述的复合植物水解酶为ViscozymeL；(2)步骤(1)的柴胡皂苷酶解液用有机溶剂萃取，合并萃取液并浓缩干燥，取固体；(3)步骤(2)的固体溶解于醇，制备液相色谱法分离，制备液相色谱分离条件为：采用C18柱，用乙腈-水作为流动相进行梯度洗脱，得到柴胡皂苷元A和柴胡皂苷元D。步骤(1)中，以柴胡的原药重量计，与复合植物水解酶的用量比为1kg：0.1～1g，优选为1kg：0.3～0.6g。或者，柴胡总皂苷与复合植物水解酶的用量比为1kg：2～15g；优选为1kg：5～12g。在本专利技术的一个优选例中，以柴胡的原药重量计，与复合植物水解酶的用量比为1kg：0.4～0.6g；柴胡总皂苷与复合植物水解酶的用量比为1kg：7～10g。步骤(1)中，柴胡总皂苷溶液的制备方法包括：柴胡粉碎后加入65％～85％乙醇，调节pH＝7.5～8.5，70～85℃回流提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.柴胡皂苷元A和D的制备方法，其特征在于，步骤包括：(1)柴胡总皂苷溶液中加入复合植物水解酶，在pH＝4.5～6的条件下，40～60℃反应15～30小时；(2)步骤(1)的柴胡皂苷酶解液用有机溶剂萃取，合并萃取液并浓缩干燥，取固体；(3)步骤(2)的固体溶解于醇，制备液相色谱法分离，制备液相色谱分离条件为：采用C18柱，用乙腈‑水作为流动相进行梯度洗脱，得到柴胡皂苷元A和柴胡皂苷元D。

【技术特征摘要】
1.柴胡皂苷元A和D的制备方法，其特征在于，步骤包括：(1)柴胡总皂苷溶液中加入复合植物水解酶，在pH＝4.5～6的条件下，40～60℃反应15～30小时；(2)步骤(1)的柴胡皂苷酶解液用有机溶剂萃取，合并萃取液并浓缩干燥，取固体；(3)步骤(2)的固体溶解于醇，制备液相色谱法分离，制备液相色谱分离条件为：采用C18柱，用乙腈-水作为流动相进行梯度洗脱，得到柴胡皂苷元A和柴胡皂苷元D。2.权利要求1所述柴胡皂苷元A和D的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的有机溶剂为氯仿；步骤(3)所述的醇为甲醇。3.权利要求1所述柴胡皂苷元A和D的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的梯度洗脱条件为：a.第一阶段时间18～25min，乙腈体积含量由30％～35％匀速变为62％～68％；b.第二阶段时间8～12min，乙腈体积含量由62％～68％匀速变为30％～35％。4.权利要求1所述柴胡皂苷元A和D的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的梯度洗脱条件为：第0～20min，乙腈体积含量由35％匀速变为66％；第20～30min，乙腈体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：王强利，赵亮，王莹，王亚辉，国海东，唐少旗，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：上海,31