本发明专利技术公开了一种GII.8型诺如病毒基因组的扩增引物和扩增方法。本发明专利技术针对GII.8型诺如病毒基因组特征采用了“4+1+1”的分段扩增策略，在保守区域设计了六组扩增引物和两条基因组末端测序引物，以目标病毒RNA为模板进行RT‑PCR扩增与测序，再通过拼接比对，获得GII.8型诺如病毒基因组序列。将该扩增方法应用于实际检出样本，成功获得我国来源的GII.8型诺如病毒基因组序列。本发明专利技术方法具有操作简单、周期短、易推广等优点，可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求及相应的科研领域。
【技术实现步骤摘要】
一种GII.8型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法
：本专利技术属于生物
，具体涉及一种GII.8型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。
技术介绍
：诺如病毒是全球急性胃肠炎的重要非细菌性病原，可感染各年龄段人群。诺如病毒感染属于自限性疾病，一般72小时内患者就会自愈，然而对于婴幼儿、老人及免疫缺陷人群会具有脱水性死亡的危险。此外，诺如病毒极易引起疫情暴发，在学校、医院、养老院、大型轮船等半封闭环境，24内就会感染其中所有易感人群。据报道，该病毒每年造成约2.3亿人次感染，在发达国家每年需花费数十亿美元用于相关治疗，而在发展中国家尤为严重，至少导致20万例5岁以下儿童的死亡。诺如病毒对公共卫生安全造成了极大的威胁，但至目前为止，还没有有效的抗病毒药物及治疗手段。作为RNA病毒，诺如病毒具有丰富的遗传多样性，根据其衣壳蛋白VP1的氨基酸序列，可以被分为六个基因组(Genogroup)GI-GVI，其中GI、GII和GVI可以感染人类。同一基因组内的诺如病毒还可以进一步分成不同的基因型，例如GI包括了至少9种基因型，GII包括了22种基因型。GII.4型诺如病毒是全球的主要流行基因型，约80％的诺如病毒感染是由该型别毒株引起的。然而，其他基因型也在病毒监测过程中被发现，例如GII.2型、GII.3型、GII.6型、GII.8型等，并且还会导致疫情的暴发。然而这些非主要流行基因型仍较少关注，因此，加强不同基因型诺如病毒的信息收集工作具有重要意义。GII.8型诺如病毒是流行病学研究中常见的非主要流行基因型之一，它最早报道于1967年的日本，此后在荷兰、土耳其、韩国、新西兰、巴西、喀麦隆等多个国家均有发现。同时，GII.8型诺如病毒在我国临床监测中往往以低感染率被检出，主要在广东、江苏等地。此外，GII.8基因型也在牡蛎、地表水监测中被发现。然而，目前该基因型已报道的基因组信息仅一条(AB039780|U25)，该毒株是于1997年发现于日本，而完整的衣壳蛋白VP1序列也仅有3条。病毒遗传信息的积累是深入研究病毒致病及进化机制的重要基础，因此开展病毒基因组扩增与测序方法具有重要意义。作为极易变异的RNA病毒，持续监测病毒的流行水平及变异情况是认识诺如病毒的重要基础。GII诺如病毒的基因组长约7.5kb，包括3个开放阅读框。我们前期工作中针对GII.4型、GII.17型诺如病毒以及GII.P12/GII.3重组型诺如病毒建立的“4+1+1”扩增策略具有操作简单、周期短、成本低以及灵敏度高的特点，因此，根据这种新颖的扩增策略，我们研发了一种针对GII.8型诺如病毒的基因组扩增引物和扩增方法，为积累我国GII.8型诺如病毒基因组资源提供了一个有力的研究工具。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种GII.8型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。具体地，本专利技术提供的GII.8型诺如病毒基因组的扩增引物，包括六对扩增引物和两条基因组末端的测序引物：引物对1：II-1F：5'-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3'；II.8-1R：5'-CTGTAGGCATCCCAGTGATC-3'；引物对2：II.8-2F：5'-TCATCTTCGCCTGACATCGT-3'；II.8-2R：5'-TCCTCTTCACAGAAGTTCTC-3'；引物对3：II.8-3F：5'-CACACTGCATTCTCCAGCAA-3'；II.8-3R：5'-CAATCCTCCAAATGCCCGA-3'；引物对4：II.8-4F：5'-GAGGAAGCCAAGAAGACAGT-3'；II-4R：5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3'；引物对5：II-5F：5'-GGAGGGCGATCGCAATC-3'；II-5R：5'-CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3'；引物对6：II.8-6F：5'-TCYAACAGTGGGGACCACC-3'；II.8-6R：5'-TCACTAAGCCCGTGACTCC-3'；测序引物：II.8-seq1R：5'-AACTCACCATCCCACATCTC-3'；II.8-seq6F：5'-GACAAGGAGATGTTGAATGC-3'；R代表A/G，H代表A/C/T，N代表碱基A/C/T/G，Y代表C/T。本专利技术还提供一种GII.8型诺如病毒基因组的扩增方法，具体为：分别以上述的引物对II-1F/II.8-1R、II.8-2F/II.8-2R、II.8-3F/II.8-3R、II.8-4F/II-4R、II-5F/II-5R、II.8-6F/II.8-6R作为扩增引物的上下游引物，以GII.8型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后采用以上每对扩增引物和测序引物II.8-seq1R、II.8-seq6F分别对相对应的扩增产物进行核酸序列测序，再通过拼接比对，获得GII.8型诺如病毒基因组全长序列。进一步地，所述的RT-PCR，其反应体系为：含有2×one-stepRT-PCRmixture10μL，10μmol/L上游引物和10μmol/L下游引物各0.6μL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0.8μL，RNA模板2μL，其余由双蒸水补足至20μL；反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术针对常见的GII.8型诺如病毒基因型，采用覆盖整个基因组的“4+1+1”的分段扩增策略，通过应用于实际检出样本的扩增、测序及序列拼接，从而获得GII.8型诺如病毒基因组序列。利用本专利技术提供的引物对GII.8型诺如病毒进行扩增和测序的方法具有操作简单、周期短、成本低以及灵敏度高等特点，可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求的机构以及相应的科研领域。附图说明：图1为GII.8型诺如病毒基因组扩增策略与相应引物的设计位置。图2为适用于GII.8型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR退火温度优化，电泳顺序为M，1-24，其中M为DNALadder，1-4、5-8、9-12、13-16、17-20、21-24分别为基因组扩增引物II-1F/II.8-1R、II.8-2F/II.8-2R、II.8-3F/II.8-3R、II.8-4F/II-4R、II-5F/II-5R、II.8-6F/II.8-6R在不同退火温度(依次为45℃、50℃、55℃、60℃)下扩增产物的电泳结果。图3为适用于GII.8型诺如病毒基因组扩增的RT-PCR引物浓度优化，图A-图F分别为引物II-1F/II.8-1R、II.8-2F/II.8-2R、II.8-3F/II.8-3R、II.8-4F/II-4R、II-5F/II-5R、II.8-6F/II.8-6R的优化结果，电泳顺序为M，1-9，其中M为DNALadder，1-3为0.2μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果，4-6为0.6μL引物分别扩增以RNA原液、RNA原液稀释10倍、RNA原液稀释100倍为模板的电泳结果本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种GII.8型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物和两条基因组末端的测序引物：引物对1：II‑1F：5'‑GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC‑3'；II.8‑1R：5'‑CTGTAGGCATCCCAGTGATC‑3'；引物对2：II.8‑2F：5'‑TCATCTTCGCCTGACATCGT‑3'；II.8‑2R：5'‑TCCTCTTCACAGAAGTTCTC‑3'；引物对3：II.8‑3F：5'‑CACACTGCATTCTCCAGCAA‑3'；II.8‑3R：5'‑CAATCCTCCAAATGCCCGA‑3'；引物对4：II.8‑4F：5'‑GAGGAAGCCAAGAAGACAGT‑3'；II‑4R：5'‑CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT‑3'；引物对5：II‑5F：5'‑GGAGGGCGATCGCAATC‑3'；II‑5R：5'‑CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT‑3'；引物对6：II.8‑6F：5'‑TCYAACAGTGGGGACCACC‑3'；II.8‑6R：5'‑TCACTAAGCCCGTGACTCC‑3'；测序引物：II.8‑seq1R：5'‑AACTCACCATCCCACATCTC‑3'；II.8‑seq6F：5'‑GACAAGGAGATGTTGAATGC‑3'；R代表A/G，H代表A/C/T，N代表碱基A/C/T/G，Y代表C/T。...
【技术特征摘要】
1.一种GII.8型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物和两条基因组末端的测序引物：引物对1：II-1F：5'-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3'；II.8-1R：5'-CTGTAGGCATCCCAGTGATC-3'；引物对2：II.8-2F：5'-TCATCTTCGCCTGACATCGT-3'；II.8-2R：5'-TCCTCTTCACAGAAGTTCTC-3'；引物对3：II.8-3F：5'-CACACTGCATTCTCCAGCAA-3'；II.8-3R：5'-CAATCCTCCAAATGCCCGA-3'；引物对4：II.8-4F：5'-GAGGAAGCCAAGAAGACAGT-3'；II-4R：5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3'；引物对5：II-5F：5'-GGAGGGCGATCGCAATC-3'；II-5R：5'-CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3'；引物对6：II.8-6F：5'-TCYAACAGTGGGGACCACC-3'；II.8-6R：5'-TCACTAAGCCCGTGACTCC-3'；测序引物：II.8-seq1R：5'-AACTCACCATCCCACATCTC-3'；II.8-seq6F：5'...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛亮，吴清平，蔡伟程，张乐，蔡淑珍，张菊梅，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，广东环凯微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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