一种水稻蜡质基因的功能标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水稻蜡质基因的功能标记及其应用。本发明专利技术中根据水稻蜡质基因Waxy在Wx

【技术实现步骤摘要】
一种水稻蜡质基因的功能标记及其应用
本专利技术属于农业生物
，特别涉及一种水稻蜡质基因的功能标记及其应用。
技术介绍
水稻籽粒淀粉直链/支链淀粉比例是水稻收获期性状，直接影响稻米的食味品质。研究揭示稻米的蒸煮与食味品质(ECQs)由直链淀粉含量(AC)、胶稠度(GC)和糊化温度(GT)形成的复杂遗传网络决定的。蜡质基因Waxy是唯一的，对AC和GC具有主效作用的基因，而对GT具有微效性，因此Waxy基因对ECQs有极大影响。水稻蜡质基因Waxy编码颗粒淀粉合成酶，是控制直链淀粉合成的主效基因，直接影响胚乳中直链淀粉的含量。Waxy位于水稻第6染色体短臂端，非糯性基因(Wx)对糯性基因(wx)表现为不完全显性，存在较明显的剂量效应；若水稻植株基因型纯合wx，产出的稻米为糯米。在非糯品种中，Waxy基因有多个等位基因，Wxa、Wxb和Wx-mq等。Wx-mq是通过化学诱变粳稻品种“越光”产生的低直链淀粉等位基因；自然产生的等位基因有Wxa和Wxb两种。其中籼稻以Wxa为主，直链淀粉含量较高，食味口感偏硬；粳稻基本为Wxb，直链淀粉含量较低，口感偏软。Wxb的第1内含子5'端剪切处发生由GT→TT的突变，导致第1内含子剪接效率降低及剪接不正常，成熟Waxy转录本含量降低，从而引起直链淀粉含量下降。有研究通过图位克隆证实Waxy还是控制粳/籼杂交胶稠度的主效QTL，影响籼粳杂交后代的食味品质。主要育种目标性状基因的功能标记开发是我国主要农作物良种创新的重点任务。作为优质水稻育种最主要的育种目标，目前仍未有针对区分Wxa和Wxb开发的功能标记。因此，对低直链淀粉稻米的选育只能通过连锁的微卫星标记多态性进行初步筛选，由于连锁可能被打破，还需在收获后对胚乳直链淀粉含量进行测定才能确定水稻Waxy基因型，整个筛选过程耗时耗力。另外，在加强籼粳亚种杂种优势利用中，为实现对广大范围育种亲本的Waxy基因型鉴定、对籼粳杂后代的Waxy基因型的筛选，均需要高效精准的Waxy功能标记作为技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种水稻蜡质基因的功能标记。本专利技术的另一目的在于提供所述水稻蜡质基因的功能标记的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种水稻蜡质基因的功能标记，所述的水稻蜡质基因共显性功能标记Waxy通过如下三条引物获得功能标记，序列方向为5’-3’：Waxy-a：CATCAGGTAGAACATCTGCAATT；Waxy-b：GGCAGAACATCTGCTAGG；Waxy-c：GAAAAACGAGCAATGAAAGATG。所述的引物用于扩增水稻基因组DNA时，在Wxa类型水稻中显示为95bp的片段，在Wxb类型水稻中显示为100bp的片段；其中，Wx表示非糯性基因，在非糯品种中，Waxy基因分化为Wxa和Wxb两种等位基因。所述的水稻蜡质基因的功能标记，采用以下步骤进行分子标记：(1)提取水稻基因组DNA；(2)PCR扩增：将所述的Waxy-a、Waxy-b和Waxy-c引物加到PCR反应体系中，并对所述水稻基因组DNA进行扩增得到扩增产物；(3)将步骤(2)中得到的扩增产物进行凝胶电泳，并进行染色，得到电泳图；(4)根据步骤(3)中得到的电泳图进行分析，如果显示为95bp的片段，则为Wxa类型水稻，如果显示为100bp的片段，则为Wxb类型水稻。步骤(1)中所述的水稻基因组DNA的提取方法为常规提取方法；优选为TPS简易法。步骤(2)中所述的PCR的反应体系为20μl反应体系：2.0μl的10×PCRbuffer；0.5μl的10mMdNTPs；10μM的Waxy-a、Waxy-b和Waxy-c各0.5μl；0.2μl的TaqDNA聚合酶，2.0μl的模板DNA；13.8μl的ddH2O。步骤(2)中所述的PCR的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸5min。步骤(3)中所述的凝胶电泳为在6％(w/w)聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳。步骤(3)中所述的染色为硝酸银染色。所述的水稻蜡质基因的功能标记在水稻育种中的应用，该水稻蜡质基因的功能标记可在水稻苗期区分水稻材料的蜡质基因类型，大大提高了选育中对直链淀粉性状的选择效率。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术旨在设计功能标记，用于区分水稻Wxa和Wxb的第1内含子剪切端差异，并提出其在分子育种中的应用。(2)本专利技术利用PCR和电泳技术即可有效地对水稻蜡质基因进行基因型筛选鉴别，可在水稻苗期区分水稻材料的蜡质基因类型，大大提高了选育中对直链淀粉性状的选择效率。附图说明图1是本专利技术蜡质功能标记的位置示意图(扩增区段的方框内碱基为目标SNP；扩增区域带有下划波浪线的序列为Waxy-c结合位置；Waxy-a和Waxy-b中下划线标注为人为引入的错配碱基)。图2是本专利技术蜡质功能标记检测3个水稻品种的电泳图；其中，M为DNA分子量marker；1为Wxb品种台中65，经Waxy功能标记检测，显示100bp的片段；2和3为Wxa品种华粳籼74和O.glaberrima，Waxy功能标记检测，显示为95bp的片段。图3是本专利技术蜡质基因功能标记检测Wxa品种华粳籼74和Wxb品种台中65杂交后代的检测结果；其中，M为DNA分子量marker；泳道1～20为F2分离群体(泳道1～5、8、9、11、13和15～18为Wxa，泳道6和20为Wxb；泳道7、10、12、14和19为杂合带型)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。本专利技术基于水稻蜡质基因Waxy在Wxa和Wxb两类等位基因(Wx表示非糯性基因)在第1内含子5'端剪切处发生GT→TT的突变，根据该位点设计了PCR功能标记。水稻蜡质基因共显性功能标记命名为Waxy，所述的Waxy包括3条引物，所述的引物方向为5’-3’，引物序列如下：Waxy-a：CATCAGGTAGAACATCTGCAATT；Waxy-b：GGCAGAACATCTGCTAGG；Waxy-c：GAAAAACGAGCAATGAAAGATG。实施例1利用功能标记Waxy检测3个水稻品种(1)提取3个水稻品种(台中65、华粳籼74和非洲稻O.glaberrima)的基因组DNA：分别取水稻苗期叶片，通过TPS简易法获得水稻基因组DNA。(2)PCR扩增PCR反应体系为20μl：2.0μl的10×PCRbuffer；0.5μl的10mMdNTPs；10μM的三种引物(Waxy-a、Waxy-b和Waxy-c)各0.5μl；0.2μl的TaqDNA聚合酶，2.0μl的模板DNA；13.8μl的ddH2O。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸5min后得到扩增产物。(3)扩增产物的检测将扩增产物在6％(w/w)聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳，硝酸银染色得到电泳图。(4)结果与分析电泳结果如图2所示，经Waxy功能标记检测，扩增片段大小与图1中设计目标一致：Wxb品种台中65，经Waxy功能标记检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻蜡质基因的功能标记，其特征在于，所述的水稻蜡质基因共显性功能标记Waxy由如下三条引物构成：Waxy‑a：CATCAGGTAGAACATCTGCAATT；Waxy‑b：GGCAGAACATCTGCTAGG；Waxy‑c：GAAAAACGAGCAATGAAAGATG。

【技术特征摘要】
1.一种水稻蜡质基因的功能标记，其特征在于，所述的水稻蜡质基因共显性功能标记Waxy由如下三条引物构成：Waxy-a：CATCAGGTAGAACATCTGCAATT；Waxy-b：GGCAGAACATCTGCTAGG；Waxy-c：GAAAAACGAGCAATGAAAGATG。2.根据权利要求1所述的水稻蜡质基因的功能标记，其特征在于：所述的引物用于扩增水稻基因组DNA时，在Wxa类型水稻中显示为95bp的片段，在Wxb类型水稻中显示为100bp的片段。3.根据权利要求1所述的水稻蜡质基因的功能标记，其特征在于，采用以下步骤进行分子标记：(1)提取水稻基因组DNA；(2)PCR扩增：将所述的Waxy-a、Waxy-b和Waxy-c引物加到PCR反应体系中，并对所述水稻基因组DNA进行扩增得到扩增产物；(3)将步骤(2)中得到的扩增产物进行凝胶电泳，并用硝酸银进行染...

【专利技术属性】
技术研发人员：张泽民，陈雄辉，梁嘉燕，邹虎成，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44