利用超高压协同酶解制备蛋清ACE抑制肽的方法技术

本发明专利技术公开了利用超高压协同酶解制备蛋清ACE抑制肽的方法。本发明专利技术为节约生产成本，提高酶解效率，通过利用超高压预处理方式降低加酶量并达到预期水解效果。本发明专利技术以蛋清粉为原料，经超高压预处理，探究100～500Mpa不同压力作用下，在30℃～45℃不同温度条件下处理5～20min后协同酶解法制备蛋清ACE抑制肽，再利用膜过滤技术将蛋清ACE抑制肽分成分子量不同的各个组分，经旋转蒸发及冷冻干燥成粉，通过液相色谱法进行活性测定，得到抑制活性较高的蛋清ACE抑制肽。同时本发明专利技术也为超高压预处理技术对鱼、虾等富含蛋白的动物资源的协同酶解制备活性肽提供参考。

Preparation of ACE inhibitory peptides from egg white by ultrahigh pressure synergistic hydrolysis

The invention discloses a method for preparing egg white ACE inhibitory peptide by ultra-high pressure synergistic enzymolysis. The invention saves production cost and improves enzymatic hydrolysis efficiency, reduces the amount of enzymatic addition by using ultra-high pressure pretreatment and achieves the desired hydrolysis effect. The present invention takes egg white powder as raw material, through ultra-high pressure pretreatment, explores the effects of 100-500 Mpa under different pressures, treats at 30-45 degrees centigrade and different temperatures for 5-20 minutes to synergize enzymatic hydrolysis to prepare egg white ACE inhibitory peptide, and then divides the egg white ACE inhibitory peptide into various components with different molecular weights by membrane filtration technology, and evaporates by rotation and evaporates. The ACE inhibitory peptide of egg white with high inhibitory activity was obtained by freeze-drying and activity determination by liquid chromatography. At the same time, the invention provides a reference for synergistic enzymatic hydrolysis of protein-rich animal resources such as fish and shrimp to prepare active peptides by ultra-high pressure pretreatment technology.

【技术实现步骤摘要】
利用超高压协同酶解制备蛋清ACE抑制肽的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种超高压协同酶解制备蛋清ACE抑制肽的方法。
技术介绍
随着人们生活方式和饮食结构的变化，高血压病发率逐年升高。据世界卫生组织统计，高血压已经成为人类第三大杀手，因此，高血压治疗迫在眉睫。血管紧张素转化酶(AngiotensinConvertingEnzyme，ACE)对生物体内血压的调节起着重要作用，不仅可以催化不具有活性的血管紧张素I转化为具有强烈收缩血管作用的血管紧张素II，还能降解具有舒张血管作用的舒缓激肽并导致其失活。因此，抑制血管紧张素转化酶活性可有助于高血压的治疗。目前临床应用的ACE抑制药存在副作用，人们将目光转向了源于食品的ACE抑制肽研究。蛋清中含有丰富的蛋白质资源，且蛋白模式与人体的蛋白模式相似，可以被人体全面吸收。蛋清氨基酸组成比较丰富，且疏水性氨基酸、脯氨酸和精氨酸等含量较高，这些氨基酸有利于得到含量较高的降血压物质。蛋清源ACE抑制肽具有抑制血管紧张素转化酶活性的作用，蛋清Alcalase酶酶解液经纯化能够获得具有较高ACE抑制活性的活性肽。为节约生产成本，提高酶解效率，考虑通过预处理方式降低加酶量并达到预期水解效果。目前对于蛋白预处理的方法主要有酸处理、碱处理、热处理、超声处理等，而超高压处理作为一种新型的加工技术，暂未被应用于食品蛋白质精深加工。超高压技术是食品加工近年来备受关注的高新技术之一。在美国及欧洲，许多国家先后对超高压食品的原理、方法、技术细节以及应用前景等方面进行了广泛的研究。超高压处理是将食品密封于弹性容器或无菌压力系统中，以水或其它流体介质为传压介质，采用100MPa以上(100～1000MPa)压力，在常温或较低温度下处理食品，使食品中酶、蛋白质、核酸和淀粉等生物大分子活性改变、变性或者糊化。超高压处理具有优良的特点：首先，它能在常温或较低温度下达到其作用，从而减少了热处理引起食品的营养成分及色、香、味的损失；其次，它传压速度快、均匀，不存在压力梯度；因此，超高压处理食品效率比较高；另外，超高压技术相对耗能较少。目前，超高压技术被认为是近年来在食品加工和保存技术中最有发展潜力的。本专利技术主要利用超高压处理对蛋清蛋白结构的影响。超高压处理主要是破坏蛋白质的三级、四级结构的非共价键，而对共价键作用较小。不同超高压力处理对蛋白质结构的影响不同。一般在100～200MPa下，蛋白质变化是可逆的；但当压力超过300MPa时，蛋白质会发生氢键断裂，产生不可逆变性而改变蛋白质的三级结构。适度的超高压作用可使蛋白质的三级和四级结构破坏，并破坏其疏水键以及离子键等非共价键，使蛋白质肽链伸展，立体结构松散。从而增大肽链与酶的接触面积，使酶解更充分，提高酶解效率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服在传统常压下蛋白质酶解达不到预期效果且生产成本较高的缺陷，采用超高压技术预处理，改善蛋清蛋白水解进程从而减少加酶量降低生产成本，并获得较高活性ACE抑制肽，本专利技术以蛋清粉为原料，经超高压预处理，探究100～500Mpa不同压力作用下，在30℃～45℃不同温度条件下处理5～20min后协同酶解法制备蛋清ACE抑制肽，再利用膜过滤技术将蛋清ACE抑制肽分成分子量不同的各个组分，经旋转蒸发及冷冻干燥成粉，通过液相色谱法进行活性测定，得到抑制活性较高的蛋清ACE抑制肽。为实现本专利技术的目的，采用以下技术方案：①超高压处理：蛋清粉配成质量分数为8％的水溶液，需将蛋清粉溶液放置在真空袋中，并用真空包装机进行封口。高压处理装置由超高压主机系统、液压泵站系统、电器控制系统和温度控制系统组成，额定压力600MPa，有效容积0.6L(60mm×210mm)，温度控制范围-10～60℃，以水作为压力传递介质，高压容器内的温度由夹套循环水进行自动控温。将包装好的蛋清粉溶液置于100～500Mpa压力下，在1～2min后达到设定压力并在30～45℃下保压5～20min，处理结束后1～2min卸压取出进行酶解。②蛋清肽酶解制备：用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节蛋清溶液pH值至9，置于50℃的恒温水浴锅中，加入5％的Alcalase蛋白酶酶解，酶解3小时。酶解过程中需用搅拌器不断搅拌，并每隔半小时加入0.2mol/L的氢氧化钠溶液，使pH值维持在9±0.05。记录每次的加碱量，并计算出总量。酶解完成后用旋转蒸发器进行浓缩并冻干成粉。③蛋清肽纯化：利用截留分子量为1KDa、3KDa和5KDa超滤膜对制备获得的蛋清肽粗品进行纯化，获得分子量分别为＜1KDa、1-3KDa、3-5KDa及＞5KDa蛋清肽组分。④采用高效液相色谱法测定抑制率。取30μL马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)底物液，加入10μL抑制剂混匀，置37℃恒温水浴中预热3到5min，然后加入20μLACE液混合均匀，37℃保温30min后，再加入60μL1mol/L的HCl终止此反应，得到反应液。同时用10μLpH值为8.3的硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作空白对照。该反应可直接用HPLC系统进行分析。色谱条件为：柱温25℃，流速为0.5mL/min，流动相乙腈/水(0.05％TFA)比例为25∶75等度洗脱，检测波长228nm。ACE抑制活性计算公式如下：ACE抑制活性(％)＝100(M-N)/M式中：M为空白对照组中马尿酸的峰面积。N为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积。⑤蛋清ACE抑制肽的红外光谱分析：采用KBr压片法进行红外光谱分析，具体操作：样品粉末1mg与干燥的KBr粉末100mg(预先放置于马弗炉中200℃干燥10h混匀后置于玛瑙研钵中研磨过筛，过筛后的粉末在红外灯下压片，采用KBr压片法在波数为400～4000cm-1范围，利用红外光谱仪IRPrestige-21进行测定，扫描方式采用透过率测定蛋清ACE抑制肽的红外光谱图。⑥蛋清ACE抑制肽的质谱分析：高ACE抑制活性的蛋清肽组分经液相色谱四极杆线性离子阱串联质谱测定其结构，质谱扫描模式采用EMS/ER/EPI/EPI，扫描范围为m/z500～1000。本专利技术的有益效果：本专利技术利用超高压预处理方式协同Alcalase酶高效制备具有较高ACE抑制活性的蛋清ACE抑制肽，通过采用超高压技术对蛋清液预处理，可使蛋清蛋白的三级和四级结构破坏，并破坏其疏水键以及离子键等非共价键，使肽链伸展，立体结构松散。从而增加蛋白酶的接触位点，使酶解更充分，并提高蛋清肽的ACE抑制活性。同时本专利技术也为超高压预处理技术对海水鱼等水产蛋白资源的酶解提供参考。附图说明图1为分子量小于1000Da的蛋清ACE抑制肽的红外光谱图；图2为分子量小于1000Da的蛋清ACE抑制肽的质谱图。具体实施方式实施例1：(1)蛋清粉配成质量分数为8％的水溶液，然后将蛋清粉溶液放置在真空袋中进行封口。将包装好的蛋清粉溶液置于400Mpa压力下，温度恒为30℃在1～2min后达到设定压力下保压20min，处理时间结束后1～2min卸压取出。(2)将超高压处理后的样品酶解：用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9，置于56℃的恒温水浴锅中，加入5％的Alcalase蛋白酶酶解，酶解3小时。酶解过程中需用搅拌器不断搅拌，并每隔半小时加入0.2mol/L的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用超高压协同酶解制备蛋清ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)超高压处理：蛋清粉配成质量分数为8％的水溶液，需将蛋清粉溶液放置在真空袋中，并用真空包装机进行封口，高压处理装置由超高压主机系统、液压泵站系统、电器控制系统和温度控制系统组成，额定压力600MPa，有效容积0.6L(60mm×210mm)，温度控制范围‑10‑60℃，以水作为压力传递介质，高压容器内的温度由夹套循环水进行自动控温，将包装好的蛋清粉溶液置于100‑500Mpa压力下，在1‑2min后达到设定压力并在30‑45℃下保压5‑20min，处理结束后1‑2min卸压取出进行酶解；(2)蛋清肽酶解制备：用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节蛋清溶液pH值至9，置于50℃的恒温水浴锅中，加入5％的Alcalase蛋白酶酶解，酶解3小时，酶解过程中需用搅拌器不断搅拌，并每隔半小时加入0.2mol/L的氢氧化钠溶液，使pH值维持在9±0.05，酶解完成后用旋转蒸发器进行浓缩并冻干成粉；(3)蛋清肽纯化：依次利用截留分子量为5KDa、3KDa和1KDa超滤膜对制备获得的蛋清肽粗品进行纯化，获得分子量小于1KDa蛋清肽组分，当小于1KDa蛋清肽浓度为10mg/mL时对ACE活性的抑制率为83％。...

【技术特征摘要】
1.利用超高压协同酶解制备蛋清ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)超高压处理：蛋清粉配成质量分数为8％的水溶液，需将蛋清粉溶液放置在真空袋中，并用真空包装机进行封口，高压处理装置由超高压主机系统、液压泵站系统、电器控制系统和温度控制系统组成，额定压力600MPa，有效容积0.6L(60mm×210mm)，温度控制范围-10-60℃，以水作为压力传递介质，高压容器内的温度由夹套循环水进行自动控温，将包装好的蛋清粉溶液置于100-500Mpa压力下，在1-2min后达到设定压力并在30-45℃下保压5-20min，处理结束后1-2min卸压取出进行酶解；(2)蛋清肽酶解制备：用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：于志鹏，张倩，赵文竹，
申请(专利权)人：渤海大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21