一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种L‑丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法。该方法包括以下步骤：将嗜热脂肪地芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶基因(alaD)按大肠杆菌密码子偏好进行优化；在优化后的所述嗜热脂肪地芽孢杆菌L‑丙氨酸脱氢酶基因的5'和3'端分别加入启动子和转录终止子；将优化后的基因进行全基因人工合成，即得。本发明专利技术提供的L‑丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法能够提高alaD在大肠杆菌中的基因表达效率，使L‑丙氨酸积累量增加，从而提高L‑丙氨酸的产量。

A method for obtaining L- synthetic alanine dehydrogenase gene and its application

The invention discloses a method for obtaining L - alanine dehydrogenase synthetic gene. The method comprises the following steps: optimizing the alanine dehydrogenase gene (alaD) of Bacillus thermophila according to the codon preference of E. coli; adding promoters and transcription terminators at the 5'and 3'ends of the optimized L_alanine dehydrogenase gene of Bacillus thermophila; and completing the optimized gene. The gene is synthesized and obtained. The method for obtaining the synthetic gene of L_alanine dehydrogenase provided by the invention can improve the gene expression efficiency of alaD in E. coli, increase the accumulation of L_alanine, and thereby increase the production of L_alanine.

【技术实现步骤摘要】
一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法及其应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法及其应用。
技术介绍
大肠杆菌是表达外源基因用于发酵生产有用基因产物的最常用平台微生物之一，L-丙氨酸的发酵生产以大肠杆菌发酵为主。但是大肠杆菌细胞中L-丙氨酸的生物合成是在谷氨酰胺-丙酮酸氨基转移酶催化下进行的；此酶催化活性较低，不能满足L-丙氨酸生产菌株培育的要求，因此L-丙氨酸生产菌多采用向大肠杆菌导入芽孢杆菌科微生物编码的具有较强丙氨酸合成能力的丙氨酸脱氢酶AlanineDehydrogenase编码基因alaD的方法获得。芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，基因组中GC含量较革兰氏阴性的大肠杆菌为高，且其基因指导酶蛋白合成时的密码子偏好也与后者不同，如果直接将芽孢杆菌的alaD导入大肠杆菌进行表达，有可能降低其基因表达效率，影响L-丙氨酸积累，进而使得L-丙氨酸的产量变低。
技术实现思路
针对现有芽孢杆菌的alaD在大肠杆菌中的基因表达效率低，进而影响L-丙氨酸积累量，使L-丙氨酸的产量变低的问题，本专利技术提供一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法。以及，本专利技术还提供上述L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法在构建高产L-丙氨酸基因工程菌中的应用。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，包括如下步骤：步骤a、将嗜热脂肪地芽孢杆菌基因按大肠杆菌密码子偏好进行优化；步骤b、在优化后的所述嗜热脂肪地芽孢杆菌L-丙氨酸脱氢酶基因的5'和3'端分别加入启动子和转录终止子；步骤c、将步骤b所得基因优化的基因进行全基因人工合成，即得。相对于现有技术，本专利技术提供的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法能够提高alaD在大肠该菌中的基因表达效率，使L-丙氨酸积累量增加，从而提高L-丙氨酸的产量。具体地，步骤a中所述L-丙氨酸脱氢酶基因经优化后的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。步骤b中所述启动子选自tac启动子、trc启动子、trp启动子、lac启动子、Pl启动子或Pr启动子；所述转录终止子选自rrnBT1终止子、rrnBT2终止子、rrnBT1结合rrnBT2终止子，或大肠杆菌核糖体RNA操纵子rrnA、rrnC、rrnD、rrnE、rrnG或rrnH的T1、T2终止子。上述启动子和终止子均为大肠杆菌的强启动子和强终止子，具有良好的转录活性。优选地，所述启动子为tac启动子。该tac启动子是将色氨酸启动子Ptrp-35区域与突变的乳糖启动子PlacUV5的-10区域融合构成的杂合启动子，转录调控活性强于2个亲本启动子，能活化L-丙氨酸脱氢酶基因的RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。优选地，所述tac启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述转录终止子为rrnBT1终止子。终止子rrnBT1的序列为大肠杆菌核糖体rRNA操纵子rrnB的强终止子序列，可以对转录终止进行有效的调控。优选地，所述转录终止子rrnBT1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。以及，本专利技术实施例还提供上述L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法在构建高产L-丙氨酸基因工程菌中的应用。所述应用的具体操作为：敲除大肠杆菌染色体的D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、丙氨酸消旋酶基因，在目标基因丙氨酸消旋酶基因同源臂与pKD3的FRT序列之间插入权利要求1所得L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因，通过RED同源重组技术进行基因替换，消除选择标记基因cat(氯霉素抗性基因)的同时将所述L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因留在丙氨酸消旋酶基因位点。相对于现有技术，该方法通过敲除上述基因，首先减少了上述基因可能存在的对L-丙氨酸生物合成所需碳流的影响，再插入L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因后，可以构建出高产L-丙氨酸的基因工程菌。附图说明图1是本专利技术实施例1中L-丙氨酸脱氢酶人工合成步骤。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1本实施例提供了一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，包括如下步骤：步骤a、将嗜热脂肪地芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因中的228个密码子按大肠杆菌密码子偏好进行优化，使优化后alaD基因中G+C数量的百分含量从59.52％降至56.54％；优化后的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；步骤b、在优化后的所述嗜热脂肪地芽孢杆菌L-丙氨酸脱氢酶基因的5'和3'端分别加入tac启动子和rrnBT1终止子，tac启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，rrnBT1终止子的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；步骤c、将步骤b所得基因优化的基因进行全基因人工合成，即得。实施例2本实施例提供了一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因在构建高产L-丙氨酸基因工程菌中的应用，具体方法为：1、D-乳酸脱氢酶基因(ldhA基因)的敲除1.1电转感受态细胞的制备甘油管保藏的大肠杆菌MG1655菌株用LB培养基培养至菌体浓度生长到OD600为0.4左右，置于冰上20分钟，使其充分冷却，在3600rpm的转速下4℃离心5分钟，弃去上清，加入少量预冷的无菌超纯水，使菌体重悬，重复离心一次，弃去上清，加入预冷的10％的无菌甘油，相同条件离心，结束后加入10％的无菌甘油，重新悬浮菌体沉淀，-80℃保存，备用。1.2pKD46质粒的转化40μLMG1655感受态细胞与1μLkD46质粒混合，加入到2mm电击杯中，轻弹底部使其混匀。电转电压设置为2.5kV，电击5.7ms左右后，在电击杯中迅速加入1mLLB液体培养基，转移到1.5mL的离心管中，30℃震荡培养2小时，培养完成后，取100μL菌液，涂布于LB+100μg/mL氨苄青霉素(以下简称Amp100)平板上，30℃倒置培养36小时。1.3MG1655/pKD46的诱导及电转感受态细胞的制备上步实验中Amp100抗性平板上长出的单菌落命名为MG1655/pKD46，挑取其单菌落接种到5mLLB+Amp100液体培养基中，30℃震荡培养过夜。过夜培养的菌液按1:100的比例加入到100mLLB+Amp100液体培养基中，加入终浓度10-60mM的L-阿拉伯糖，培养至OD600约0.4，冰上冷却20min后制成MG1655/pKD46电转感受态细胞，制备方法如1.1所述。1.4线性DNA(打靶分子)的扩增以pKD3为模板，针对不同的基因设计不同的正反向引物，扩增含有FRT位点的氯霉素抗性基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测无误后，用试剂盒进行回收，最后用无菌超纯水进行洗脱保存。PCR反应体系及反应程序如表1、2所示，表1为用于ldhA基因敲除的线性DNA打靶分子PCR组分，表2为用于ldhA基因敲除的线性DNA打靶分子PCR条件。表1其中引物1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，引物2的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。表21.5线性DNA(打靶分子)的转化取诱导好的MG1655/pKD46电转感受态细胞40μL和4μL(约400ng)线性DNA，加入到2mm电击杯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L‑丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a、将嗜热脂肪地芽孢杆菌的L‑丙氨酸脱氢酶基因按大肠杆菌密码子偏好进行优化；步骤b、在优化后的所述嗜热脂肪地芽孢杆菌L‑丙氨酸脱氢酶基因的5'和3'端分别加入启动子和转录终止子；步骤c、将步骤b所得基因优化的基因进行全基因人工合成，即得。

【技术特征摘要】
1.一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a、将嗜热脂肪地芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因按大肠杆菌密码子偏好进行优化；步骤b、在优化后的所述嗜热脂肪地芽孢杆菌L-丙氨酸脱氢酶基因的5'和3'端分别加入启动子和转录终止子；步骤c、将步骤b所得基因优化的基因进行全基因人工合成，即得。2.根据权利要求1所述的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，步骤a中所述L-丙氨酸脱氢酶基因经优化后的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1所述的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，步骤b中所述启动子选自tac启动子、trc启动子、trp启动子、lac启动子、Pl启动子或Pr启动子；和/或步骤b中所述转录终止子选自rrnBT1终止子、rrnBT2终止子、rrnBT1结合rrnBT2终止子，或大肠杆菌核糖体RNA操纵子rrnA、rrnC、rrnD、rrnE、rrnG或rrnH的T1、T2终止子。4.根据权利要求3所述的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：康明，张仲良，王亚森，田晓辉，张习伟，李霆，
申请(专利权)人：河北大学，精晶药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13