一种(S)-羰基还原酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种来源于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的羰基还原酶基因、其编码酶，以及含有该基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系及重组菌。本发明专利技术公开的羰基还原酶ReADH具有优良的酶学特性，其最适pH值为6.0，最适反应温度为40℃，在30℃下保温24h有良好的稳定性。用本发明专利技术的羰基还原酶可以高效转化苯乙酮，转化率大于99％，且合成(S)‑α‑苯乙醇e.e.值是100％，具有良好的工业化应用前景。

A (S) - carbonyl reductase and its coding genes and Application

The present invention provides a carbonyl reductase gene from Rhodococcus erythropolis, its coding enzyme, an expression box containing the gene, a recombinant vector, a transgenic cell line and a recombinant bacterium. The carbonyl reductase ReADH disclosed by the invention has excellent enzymatic characteristics, the optimum pH value is 6.0, the optimum reaction temperature is 40 C, and the stability is good when the carbonyl reductase ReADH is kept at 30 C for 24 hours. The carbonyl reductase of the invention can efficiently convert acetophenone, the conversion rate is more than 99%, and the e.e.value of (S)alpha_phenylethanol is 100%, which has a good industrial application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种(S)-羰基还原酶及其编码基因与应用
本专利技术涉及生物催化
，尤其涉及一种(S)-羰基还原酶、其编码基因、含有该基因的载体及重组菌以及在催化不对称还原前手性羰基化合物中的应用。
技术介绍
羰基还原酶(EC1.1.1.184)是众多氧化还原酶中的一种，对酮类、醛类底物有特异性的催化能力，可以将其转化为醇类产物，转化过程中需以辅酶NADP(H)或NAD(H)作为电子受体，具有高度的辅酶依赖性。在自然界中，羰基还原酶的存在非常普遍，从低等微生物如细菌、酵母，到一些高等植物、动物组织中均有分布。而在手性醇的合成应用中，尤以微生物来源的羰基还原酶研究居多。微生物中存在的羰基还原酶有不同的分类方法，根据催化机理及三维结构主要分为以下几类：醛酮还原酶家族(aldo-ketoreductasesuperfamily,AKR)、短链脱氢酶/还原酶家族(short-chaindehydrogenase/reductase,SDR)、Zn依赖醇脱氢酶/还原酶家族(zinc-dependentalcoholdehydrogenases,ADH)。羰基还原酶中短链脱氢酶每个分子大约有250-350个氨基酸，没有金属离子，不同来源的短链脱氢酶相互之间的同源性较低，多为15％-30％左右。至今为止，在蛋白数据库中已有两万多的短链脱氢酶序列被提交，其中大约有3/4来源于细菌。随着手性化合物的广泛应用，关于手性化合物高效制备的研究日显重要，特别是在农业、医药以及化工等主要需求领域。具有光学活性的芳基手性醇作为具有高附加值的手性砌块，在医药、农业和精细化工领域扮演了重要的角色。然而目前手性醇的制备主要依赖化学合成，但化学法会造成严重污染，破坏人们的生活环境。生物催化法以其环境友好、反应条件温和、对底物专一等优点逐渐成为了手性醇制备最具前景的研究方向。羰基还原酶是一种具备高度的化学选择性、区域选择性、立体对映选择性的生物催化剂，通过不对称还原反应可以将潜手性酮底物转化为具有光学纯度的芳基手性醇，是一种高效的生物转化途径。最近几十年越来越多的羰基还原酶被用于手性醇的合成。如Pollard(PollardD,TruppoM,PollardJ,etal.Effectivesynthesisof(S)-3,5-bistrifluoromethylphenylethanolbyasymmetricenzymaticreduction.Tetrahedron:Asymmetry,2006,17(4):554-559)等人为了提高产物(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的时空产率，利用羰基还原酶辅酶再生体系进行不对称转化，反应获得的(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇时空产率高达260g·L-1·d-1；朱敦明等(ZhuD,YangY,HuaL.StereoselectiveenzymaticsynthesisofchiralalcoholswiththeuseofacarbonylreductasefromCandidamagnoliaewithAnti-Prelogenantioselectivity.TheJournalofOrganicChemistry,2006,71(11):4202-4205)以羰基还原酶Candidamagnoliae为生物催化剂催化多种苯乙酮衍生物，反应所得产物的光学纯度均高达99％以上。(S)-α-苯乙醇，是一种用于合成多类药物的手性中间体，它是免疫增强剂左旋咪唑、治疗哮喘的药物(S)-异丙肾上腺素、抗抑郁药物取舍林等合成的前体。当前(S)-α-苯乙醇的制备主要是通过化学法和生物法来进行。与传统化学合成技术相比，羰基的不对称生物还原具有立体选择性强、催化效率高、反应条件温和、以及生产过程对环境友好等优势。因此，近年来利用羰基还原酶不对称还原苯乙酮成为生产该类手性醇的方法。而开发一些新型、高效、稳定，能够适应多变生产环境的羰基还原酶成为了生物催化工业的核心，对于工业制备(S)-α-苯乙醇具有重要的研究意义和实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)的羰基还原酶ReADH及其其编码基因。本专利技术的另外一个目的在于提供一种含有上述羰基还原酶ReADH编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系及重组菌。本专利技术再一个目的在于提供上述在羰基还原酶ReADH还原苯乙酮生成(S)-α-苯乙醇中的应用。本专利技术的技术方案如下：一种来源于红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)的羰基还原酶基因，其核苷酸序列为如下1)-3)中任一所述的基因：1)SEQIDNO：1所示的基因；2)在高严谨条件下与1)所述基因杂交且编码相同蛋白的基因；3)与1)或2)所述的基因具有90％以上的同源性且编码相同蛋白的基因；上述高严谨条件为用0.1×SSPE或SSC，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。所述羰基还原酶基因优选由如下方法得到：利用PCR技术，在引物ReADH-F(SEQIDNO：3)和引物ReADH-R(SEQIDNO：4)的作用下，以红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)的总基因组DNA为模板，扩增得到羰基还原酶基因序列。本专利技术还包括上述羰基还原酶基因编码的羰基还原酶ReADH，是如下a或b的蛋白质：a、SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b、SEQIDNO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羰基还原酶活性的衍生蛋白质。如SEQIDNO：2的氨基酸残基序列第184位丙氨酸取代天冬氨酸形成的蛋白质仍具有羰基还原酶活性。优选的，所述SEQIDNO：2所示序列的羰基还原酶ReADH分子量约为36kDa。为了使a中的蛋白便于纯化，可在SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签中的一种。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述b中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b中的蛋白的编码基因可通过将SEQIDNO：1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。本专利技术还包括含有上述羰基还原酶基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系及重组菌。本专利技术所述含有上述羰基还原酶基因的表达盒，优选还含有T7启动子，LacI操纵子和T7终止子。所述重组载体包括上述技术方案所述羰基还原酶编码基因和表达载体，本专利技术所述羰基还原酶ReADH基因表达的载体可以为pET、pCW、pUC或者pPIC9k等。本专利技术所述重组载体优选是将上述羰基还原酶编码基因插入pET-28a(+)的多克隆位点得到。具体地讲，是将pET-28a(+)的NdeI和BamHI限制性酶切位点之间的小片段取代为本专利技术所述羰基还原酶基因得到的重组质粒。本专利技术所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来源于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的羰基还原酶基因，其核苷酸序列为如下1)‑3)中任一所述的基因：1)SEQ ID NO：1所示的基因；2)在高严谨条件下与1)所述基因杂交且编码相同蛋白的基因；3)与1)或2)所述的基因具有90％以上的同源性且编码相同蛋白的基因；上述高严谨条件为用0.1×SSPE或SSC，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

【技术特征摘要】
1.一种来源于红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)的羰基还原酶基因，其核苷酸序列为如下1)-3)中任一所述的基因：1)SEQIDNO：1所示的基因；2)在高严谨条件下与1)所述基因杂交且编码相同蛋白的基因；3)与1)或2)所述的基因具有90％以上的同源性且编码相同蛋白的基因；上述高严谨条件为用0.1×SSPE或SSC，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述SEQIDNO：1核苷酸序列由红平红球菌总DNA为模板，以SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示引物扩增得到。3.一种由权利要求1或2所述羰基还原酶基因编码的(S)-羰基还原酶ReADH。4.根据权利要求3所述的(S)-羰基还原酶ReADH，其特征在于，是如下a或b的蛋白质：a、SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b、SEQIDNO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有羰基还原酶活性的衍生蛋白质。5.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾振华，李冉，宋水山，宋聪，黄亚丽，黄媛媛，赵芊，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13