一个影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因制造技术

本申请属于烟草基因工程领域，具体涉及一个影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因。该基因包括1218bp碱基，具体核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，其中第68~403位核苷酸为特异性核酸片段。该基因所编码的异丙基苹果酸脱氢酶NtIPMD，其特征在于，异丙基苹果酸脱氢酶NtIPMD包括405个氨基酸。本申请针对NtIPMD基因的初步研究表明，该基因与植株的腋芽发育相关，将该基因沉默后，可促进侧枝发育，利用这一特性，可以通过基因沉默或超表达技术将基因进行沉默或超表达，从而实现分子水平上对于该植株株型的调整，同时对于烟草新品种培育具有重要影响，因而具有较为重要的实用价值。

A NtIPMD gene affecting tobacco axillary bud differentiation

The application belongs to the field of tobacco genetic engineering, in particular to a NTIPMD gene affecting axillary bud differentiation of tobacco. The gene consists of a 1218 BP base. The specific nucleotide sequence SEQ ID NO.1 shows that the 68-403 nucleotides are specific nucleic acid fragments. The gene encodes the isopropyl malic dehydrogenase NtIPMD, which is characterized by the inclusion of 405 amino acids in the isopropyl malic dehydrogenase NtIPMD. The preliminary study on NtIPMD gene showed that NtIPMD gene was related to axillary bud development of plant. Silencing NtIPMD gene could promote lateral shoot development. Using this characteristic, NtIPMD gene could be silenced or over-expressed by gene silencing or over-expression technology, and the plant type could be adjusted at molecular level. At the same time, it has an important influence on the cultivation of new varieties of tobacco, so it has more important practical value.

【技术实现步骤摘要】
一个影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因
本申请属于烟草基因工程领域，具体涉及一个影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因。
技术介绍
烟草（Nicotianatabacum）是重要的经济作物，烟叶叶片是其主要利用部位。栽培生长过程中，为提高生产效益，在烟叶生长后期，为减少烟叶中的营养成分向生殖器官的转移，需要采取“打顶”的操作。这一操虽然破坏了植物的顶端优势，减少了烟叶中营养成分的转移，但同时易于导致侧枝分生，因此若不及时抹掉侧芽，同样会消耗叶片中营养，进而影响烟叶产量。因此，研究烟草腋芽分化生长的机理将有助于通过分子手段控制植物的分枝，对烟草株型的调控研究具有重要的理论和现实意义。但总体而言，现有烟草研究中，有针对性的针对烟草腋芽分化、分生机理的研究相对匮乏，由此也导致尚无较好的采用分子手段调控烟草株型的研究报道。现有研究认为，异丙基苹果酸脱氢酶（IsopropylMalateDehydrogenase，IPMD）在植物中主要参与亮氨酸代谢，因此也简称为LeuB。在拟南芥中，针对IPMD的研究认为，该蛋白还参与芥子油苷生物合成途径中的蛋氨酸链延伸过程。研究认为，在拟南芥中，共有三个IPMD亚型（AtIPMD1-3），将AtIPMD2或AtIPMD3基因单独沉默后，植株并无明显表型，如果将AtIPMD2和AtIPMD3一起沉默后则能够影响花粉和胚囊发育（FunctionalcharacterizationofArabidopsisthalianaisopropylmalatedehydrogenasesrevealstheirimportantrolesingametophytedevelopment，NewResearchPhytologist，2010）。而在本氏烟草中，有报道称IPMD参与了酰基糖代谢途径（TranscriptomicandReverseGeneticAnalysesofBranched-ChainFattyAcidandAcylSugarProductioninSolanumpennelliiandNicotianabenthamiana，PlantPhysiology，2008），但该基因在烟草中的具体功能尚无报道。本申请针对NtIPMD基因的初步研究表明，该基因与植株的腋芽发育相关，将该基因沉默后，可促进侧枝发育，利用这一特性，可以通过基因沉默或超表达技术将基因进行沉默或超表达，从而实现分子水平上对于该植株株型的调整，同时对于烟草新品种培育具有重要影响，因而具有较为重要的实用价值。
技术实现思路
本专利技术主要是提供一个影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因。通过对该基因的研究，发现该基因在烟草腋芽分化调控中具有重要作用，基于此功能，该基因在烟草基因工程育种中具有重要应用前景。本申请所采取的技术方案详述如下。一个影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因，包括1218bp碱基，具体核苷酸序列SEQIDNO.1所示，其中第68~403位核苷酸为特异性核酸片段；该基因所编码的异丙基苹果酸脱氢酶NtIPMD（IsopropylMalateDehydrogenase），包括405个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因，具体来源于烟草（Nicotianatabacum）。获得所述影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因的PCR扩增方法，PCR扩增时，以所提取烟草基因组并反转录获得的cDNA为模板，扩增用引物序列设计为：F：5’-CACCATCACGGATCCATGGCGGCTTCCTTAC-3’，R：5’-TGGCTGCAGGTCGACTTAAACAGCAGCGGGAG-3’。所述影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因在烟草育种中的应用，将该基因沉默后，烟草腋芽分化数量增加，后期进一步分化生长为侧枝；所述基因沉默，具体可利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术或RNAi干扰技术，在烟草中干扰其表达，进而获得基因沉默植株。利用所述影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因所构建的基因沉默用重组载体TRV-NtIPMD，具体通过如下步骤构建获得：（1）提取烟草基因组，并反转录为cDNA，进行PCR扩增；PCR扩增时，引物序列设计如下：F：5’-CGACGACAAGACCCTCCAAACACGCCGCTAAAT-3’，R：5’-GAGGAGAAGAGCCCTGGTGAAGCAATGCCATCT-3’；以所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增即可获得该特异性片段；（2）将步骤（1）中PCR扩增后特异性片段与载体TRV连接，转化大肠杆菌DH5α，进一步筛选鉴定后，提取质粒测序正确后，即获得重组载体TRV-NtIPMD。附图说明图1为与对照植株相比，NtIPMD基因沉默植株中该基因的相对表达量；图2为病毒诱导NtIPMD基因沉默植株腋芽分化表型。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验设备等基本情况简要介绍说明如下。生物材料：本氏烟草，一种常用烟草品种，为可公开获得烟草材料；基因沉默用载体（TRV1、TRV2），购自中国质粒载体菌细胞基因保藏中心；农杆菌菌株，基因工程中常用生物菌株；相关引物合成及测序，由上海生工提供完成；实验试剂：LATaq酶、PstI限制性内切酶，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等，购自Takara公司，In-Fusion一步法克隆试剂盒，购自clontech公司；RNA提取试剂盒，购自于GeneAnswer公司；反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒，购自Roche公司；蛋白胨、酵母提取物等，购自Oxoid公司；部分试剂配制方法简要说明如下：（1）LB液体培养基（1L）：10g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone）；10g氯化钠（NaCl）；5g酵母抽提物（Yeastextract），高温高压灭菌；（2）1M2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH2O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；（3）200mM乙酰丁香酮（Acetosyringone）储备液：无水乙醇溶解，-20℃储存备用；实验设备：PCR仪Tgradient，Biometra公司产品，实时定量PCR仪LightCycler96，Roche公司产品。实施例1本实施例主要就影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因的获得过程，简要介绍如下。以栽培种烟草叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA备用；通过同源比对的方法，参考拟南芥NtIPMD基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：F：5’-CACCATCACGGATCCATGGCGGCTTCCTTAC-3’，R：5’-TGGCTGCAGGTCGACTTAAACAGCAGCGGGAG-3’；以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增；50μL扩增体系设计如下：上游引物（F引物），1μL；下游引物（R引物），1μL；cDNA模板，1μL；10×buffer，5μL；dNTP，6μL；EazyTaq酶，1μL；ddH2O加至50μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因，其特征在于，该基因包括1218bp碱基，具体核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，其中第68~403位核苷酸为特异性核酸片段。

【技术特征摘要】
1.一个影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因，其特征在于，该基因包括1218bp碱基，具体核苷酸序列SEQIDNO.1所示，其中第68~403位核苷酸为特异性核酸片段。2.权利要求1所述影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因所编码的异丙基苹果酸脱氢酶NtIPMD，其特征在于，异丙基苹果酸脱氢酶NtIPMD包括405个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因的PCR扩增方法，其特征在于，PCR扩增时，扩增用引物序列设计为：F：5’-CACCATCACGGATCCATGGCGGCTTCCTTAC-3’，R：5’-TGGCTGCAGGTCGACTTAAACAGCAGCGGGAG-3’。4.权利要求1所述影响烟草腋芽分化的NtIPMD基因在烟草育种中的应用，其特征在于，将该基因沉默后，烟草腋芽分化数量增加，后...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧，徐国云，金静静，周会娜，翟妞，刘萍萍，陈千思，金立锋，郑庆霞，陈霞，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41