耐热性提高的甘露聚糖酶PMan5A突变体及其基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种耐热性能提高的甘露聚糖酶突变体及其基因和应用，其以来源于青霉菌Penicillium sp.WN1的GH5家族甘露聚糖酶PMan5A为母本，采用分子生物学手段将母本中第93、94、356和389位点的组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)和丙氨酸(A)突变成酪氨酸(Y)、酪氨酸(Y)、组氨酸(H)和脯氨酸(P)。结果显示，单点突变体H93Y、L356H和A389P的耐热特性较野生酶PMan5A均有大幅度提高，并且组合突变体H93Y/F94Y、H93Y/L356H、H93Y/A389P、L356H/A389P、H93Y/F94Y/L356H、H93Y/L356H/A389P、H93Y/F94Y/L356H/A389P的耐热性表现出单点突变的叠加效应，说明PMan5A的93、94、356和389位点在GH5家族甘露聚糖酶的耐热特性中扮演了重要角色，这可能对其它GH5家族(α/β)8桶状酶的耐热性能机制的研究具有重要的指导意义。

Mannan PMan5A mutant with high heat resistance and its gene and Application

The invention discloses a mannanase mutant with improved heat resistance and its gene and application. The GH5 mannanase PMan5A family derived from Penicillium sp. WN1 is used as female parent, and histidine (H), phenylalanine (F), leucine (L) and leucine (L) at sites 93, 94, 356 and 389 of the female parent are used as molecular biological means. Alanine (A) mutated into tyrosine (Y), tyrosine (Y), histidine (H) and proline (P). The results showed that the heat tolerance of single-point mutants H93Y, L356H and A389P was significantly higher than that of wild-type enzymes PMan5A, and the heat tolerance of combination mutants H93Y/F94Y, H93Y/L356H, H93Y/A389P, L356H/A389P, H93Y/F94Y/L356H, H93Y/L356H/A389P, H93Y/F94Y/L356H/A389P and H93Y/F94Y/L356H/A389P showed the superposition effect of single-point mutation. Loci 93, 94, 356 and 389 of 5A play an important role in the thermostability of GH5 mannanases, which may be of great significance to the study of thermostability mechanism of other GH5 (alpha/beta) 8 barrel enzymes.

【技术实现步骤摘要】
耐热性提高的甘露聚糖酶PMan5A突变体及其基因和应用
本专利技术涉及农业生物
具体地，本专利技术涉及热稳定性提高的甘露聚糖酶PMan5A突变体及其基因和应用。
技术介绍
甘露聚糖是植物半纤维素的主要成分，主要存在于软木植物及一些特殊结构如植物种子中，它也是重要的植物性饲料原料。甘露聚糖的结构比较复杂，其主链是以1,4-β-D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性多糖，并且主链或侧链具有多种取代基。由于甘露聚糖的多样性与结构的复杂性，它的完全水解需要多种酶的协同作用才能完成，包括内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、乙酰甘露聚糖酯酶和α-半乳糖苷酶等。其中，内切-β-甘露聚糖酶能够降解甘露聚糖主链的β-1,4-糖苷键，是甘露聚糖降解过程中发挥最重要作用的酶。按照糖苷水解酶家族分类，目前所发现的内切-β-甘露聚糖酶可以分为GH5，26，113或134家族，其中，有关GH5家族β-甘露聚糖酶的报道已有许多，但由于其对极端环境耐受性差、催化活性低和对底物亲和力弱等缺点极大地限制了其在各领域的应用，并催生了新型酶基因的开发及酶分子改造方面的研究。影响β-甘露聚糖酶结构与特性因素有很多，包括氢键、盐桥、二硫键，蛋白质的热稳定性与多种结构特性因素相关。
技术实现思路
针对现有的β-甘露聚糖酶的耐受能力差、催化活性低的问题，本专利技术通过将PMan5A中第93、94、356和389位点的氨基酸H、F、L和A分别突变为Y、Y、H和P，或组合突变，获得热稳定性提高的甘露聚糖酶突变体。本专利技术的目的是提供包含单点H93Y、F94Y、L356H、A389P及组合H93Y/F94Y、H93Y/L356H、H93Y/A389P、L356H/A389P、H93Y/F94Y/L356H、H93Y/L356H/A389P、H93Y/F94Y/L356H/A389P突变的突变体。本专利技术的再一目的是提供编码上述突变体的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株。根据本专利技术的技术方案，野生甘露聚糖酶PMan5A的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：其中，该酶N端前19个氨基酸为信号肽序列“MKSAILILPFLSHLAVSQT”。根据本专利技术的技术方案，对野生型甘露聚糖酶PMan5A成熟蛋白进行改造，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：根据本专利技术的耐热性提高的甘露聚糖酶PMan5A突变体，是通过将成熟的甘露聚糖酶PMan5A进行H93Y、F94Y、L356H和/或A389P点突变而获得，其中，将甘露聚糖酶成熟蛋白的N端第93位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)，获得突变体H93Y，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示：根据本专利技术具体实施方式，突变体F94Y的甘露聚糖酶成熟蛋白的N端第94位苯丙氨酸(F)突变为酪氨酸(Y)，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示：根据本专利技术具体实施方式，突变体L356H的甘露聚糖酶成熟蛋白的C端第356位亮氨酸(L)突变为组氨酸(H)，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示：根据本专利技术具体实施方式，突变体A389P的甘露聚糖酶成熟蛋白的C端第389位丙氨酸(A)突变为脯氨酸(P)，其氨基酸序列如SEQIDNO.6所示：根据本专利技术具体实施方式，突变体H93Y/F94Y的甘露聚糖酶成熟蛋白的N端第93位组氨酸(H)和第94位苯丙氨酸(F)均突变为酪氨酸(Y)，其氨基酸序列如SEQIDNO.7所示：根据本专利技术具体实施方式，突变体H93Y/L356H的甘露聚糖酶成熟蛋白的N端第93位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)，及C端第356位亮氨酸(L)突变为组氨酸(H)，其氨基酸序列如SEQIDNO.8所示：根据本专利技术具体实施方式，突变体H93Y/A389P的甘露聚糖酶成熟蛋白的N端第93位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)，及C端第389位丙氨酸(A)突变为脯氨酸(P)，其氨基酸序列如SEQIDNO.9所示：根据本专利技术具体实施方式，突变体L356H/A389P的甘露聚糖酶成熟蛋白的C端第356位亮氨酸(L)突变为组氨酸(H)，及第389位丙氨酸(A)突变为脯氨酸(P)，其氨基酸序列如SEQIDNO.10所示：根据本专利技术具体实施方式，突变体H93Y/F94Y/L356H的甘露聚糖酶成熟蛋白的N端第93位组氨酸(H)和第94位苯丙氨酸(F)均突变为酪氨酸(Y)，及C端第356位亮氨酸(L)突变为组氨酸(H)，其氨基酸序列如SEQIDNO.11所示：根据本专利技术具体实施方式，突变体H93Y/L356H/A389P的甘露聚糖酶成熟蛋白的N端第93位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)，及C端第356位亮氨酸(L)突变为组氨酸(H)和第389位丙氨酸(A)突变为脯氨酸(P)，其氨基酸序列如SEQIDNO.12所示：根据本专利技术具体实施方式，突变体H93Y/F94Y/L356H/A389P的甘露聚糖酶成熟蛋白的N端第93位组氨酸(H)和第94位苯丙氨酸(F)均突变为酪氨酸(Y)，及C端第356位亮氨酸(L)突变为组氨酸(H)和第389位丙氨酸(A)突变为脯氨酸(P)，其氨基酸序列如SEQIDNO.13所示：本专利技术还提供了一种制备热稳定提高的甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：(1)用上述包含突变体编码基因的重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶PMan5A突变体表达；(3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶PMan5A突变体。本专利技术的有益效果：本专利技术通过对成熟的甘露聚糖酶Pman5A的第93H、94F、356L和389A位点进行单点及组合突变，构建了11个突变体，并将突变体重组载体转化毕赤酵母GS115，实现了突变体酵母工程菌的构建。对突变体和野生甘露聚糖酶Pman5A进行大瓶诱导，蛋白浓缩与纯化，并进行了耐热性质与催化效率的测定与分析。分析实验结果表明，单点突变体Pman5A-H93Y和Pman5A-A389P在高温条件下的酶活要明显高于野生甘露聚糖酶Pman5A，而突变体Pman5A-F94Y和突变体Pman5A-L356H的最适温度没有发生变化，且在各个温度下表现出与野生酶Pman5A相似的相对酶活力。两点组合突变体H93Y/F94Y、H93Y/L356H、H93Y/A389P和L353/A389P的最适温度比野生甘露聚糖酶Pman5A提高了10℃、10℃、15℃和5℃，其最适温度的提高相对于单点突变体H93Y和A389P表现出叠加效应。同样组合突变体H93/L353/A389P与H93/F94Y/L353/A389P表现出相同的叠加效应，最适温度提高到85℃。耐热性测定中，甘露聚糖酶Pman5A突变体H93Y、L356H和A389P对70℃耐受性提高，并且H93和A389两位点突变后提高更明显。组合突变体的热稳定性与野生甘露聚糖酶Pman5A相比都是提高的。单点突变体中H93Y、L356H和A389P的T50值比野生甘露聚糖酶Pman5A分别提高了7℃、2℃和4℃，而突变体F94Y的T50值并没有变化，可见三个位点是促进GH5甘露聚糖酶PMan5A热稳定性提高关键位点，并且其效应H93Y>A389P>L356H。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.耐热性提高的甘露聚糖酶PMan5A突变体，其特征在于，所述甘露聚糖酶PMan5A突变体通过将成熟的甘露聚糖酶PMan5A进行H93Y、F94Y、L356H和/或A389P点突变获得，所述成熟的甘露聚糖酶PMan5A的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.耐热性提高的甘露聚糖酶PMan5A突变体，其特征在于，所述甘露聚糖酶PMan5A突变体通过将成熟的甘露聚糖酶PMan5A进行H93Y、F94Y、L356H和/或A389P点突变获得，所述成熟的甘露聚糖酶PMan5A的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。2.耐热性提高的甘露聚糖酶PMan5A突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的耐热性提高的甘露聚糖酶PMan5A突变体。3.包含权利要求2所述的耐热性提高的甘露聚糖酶PMan5A突变体基因的重组载体。4.包含权利要求2所述的耐热性提高的甘露聚糖酶PMan5A突变体基因的重组菌株。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：罗会颖，姚斌，刘伟娜，顾原，涂涛，王苑，王亚茹，黄火清，柏映国，苏小运，孟昆，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11