一种新型酿酒酵母表达体系及其构建方法技术

本发明专利技术利用RNA聚合酶I在rDNA基因转录方面的高效作用，用rDNA基因启动子启动外源或内源基因表达，构建了一种新型酿酒酵母表达体系。一种酿酒酵母新型表达体系及其构建方法，包括一种新型表达载体，所述载体从5’到3’依次包括YEplac195质粒骨架、外源基因表达盒、筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括rDNA启动子、内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site，IRES）序列、外源基因表达框、poly(T)序列、rDNA终止子；所述筛选标记基因表达盒包括启动子、筛选标记基因、转录终止子。本发明专利技术的表达系统可实现外源基因在酿酒酵母中的高效表达，对酿酒酵母产品开发及基础理论研究具有重要的意义，同时对于酿酒酵母中RNA聚合酶I介导的调控机制和rRNA合成机制的研究也具有重要的意义。

A new expression system of Saccharomyces cerevisiae and its construction method

A novel expression system of Saccharomyces cerevisiae was constructed by utilizing the high efficiency of RNA polymerase I in transcription of rDNA gene and using rDNA gene promoter to promote the expression of exogenous or endogenous genes. A novel expression system of Saccharomyces cerevisiae and its construction method comprise a novel expression vector, which in turn comprises a YEplac195 plasmid skeleton, an exogenous gene expression box and a screening marker gene expression box, and the exogenous gene expression box comprises an rDNA promoter and an internal ribosome entry from upstream to downstream in turn. Internal ribosome entry site (IRES) sequence, foreign gene expression frame, poly (T) sequence, rDNA terminator; the screening marker gene expression box includes promoter, screening marker gene, transcription terminator. The expression system of the invention can realize high-level expression of foreign genes in Saccharomyces cerevisiae, which is of great significance for the development of Saccharomyces cerevisiae products and basic theoretical research, and also has important significance for the regulation mechanism mediated by RNA polymerase I in Saccharomyces cerevisiae and the research of rRNA synthesis mechanism.

【技术实现步骤摘要】
一种新型酿酒酵母表达体系及其构建方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种新型酿酒酵母表达体系及其构建方法。
技术介绍
随着基因组学研究的迅速发展，如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等多种表达体系应运而生，以满足挖掘新基因及其新功能，构建新型工程菌等的迫切需求。酵母表达体系有很多，如酿酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母和产朊假丝酵母等，其中酿酒酵母和毕赤酵母是最常用的两种表达系统。酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae），又称面包酵母，长期应用于酿酒、面包和馒头制作等，安全可靠，不产生毒素，是国际公认的食品安全级（GenerallyRegardedAsSafe，GRAS）真核微生物；由于其菌体细胞富含营养，具很高的经济价值，酵母抽提物或酵母浸出物（YeastExtract）不仅广泛用于微生物、动植物细胞培养，在制药、酿造及发酵食品中有着举足轻重的作用，而且也直接用于饲料及食品添加剂；由于酵母在工业生产中具有良好的发酵性能，在发酵过程中能够快速分裂，容易培养，对杂菌污染具有较强的抗性，遗传背景清晰，基因操作简单等优势，使其在基因工程技术中常被用于代谢工程改造的出发菌株；在新近推崇的合成生物学研究中，酿酒酵母因其特殊的代谢能力等特点已成为备受关注的底盘细胞，可用于不同作用微生物细胞工厂的构建；相较于原核生物，能识别真核基因帮助其进行转录翻译后修饰，表达蛋白接近天然构象，并且可以将外源蛋白分泌至胞外，有利于表达产物纯化；作为模式物种之一，有许多涉及人类遗传性疾病的基因均与酵母基因具有很高的同源性，所以酵母还可以作为高等真核生物特别是人类基因组研究的模式生物，以提高基因诊断和治疗水平；以酿酒酵母为代表的酵母表达体系已成为生产生物基化学品、表达新型外源基因，服务于工农业和医药领域的重要工具。通常情况下，酿酒酵母与其他真核生物一样，至少产生三种主要的RNA，包括核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）和信使RNA（mRNA），其中，rRNA是由RNA聚合酶I负责合成的，表达编码的蛋白质是由RNA聚合酶II负责合成的，tRNA和5SrRNA则是由RNA聚合酶III负责合成的。外源基因在酵母中的表达效率与启动子强度、RNA聚合酶II调控的mRNA的转录效率等因素有关，目前使用的酿酒酵母表达体系因缺乏强有力的启动子，及受到其他方面因素的影响，利用酿酒酵母发酵生产时，高水平表达外源基因尚有难度。酿酒酵母产生的rRNA占总RNA含量的80%[WarnerJR.Theeconomicsofribosomebiosynthesisinyeast.TrendsBiochemSci.1999,24(11):437–440]，其与核糖体蛋白质和其他一些关联的蛋白在细胞核内组装形成大小亚基，并转运出核，在细胞质中组装成成熟的核糖体，实现蛋白质的翻译。细胞每分钟产生约2000个核糖体[WarnerJR.Theeconomicsofribosomebiosynthesisinyeast.TrendsBiochemSci.1999,24(11):437–440.]。编码rRNA的rDNA基因一般以约150~200个重复的单元拷贝随机地位于染色体XII上[PetesTD:YeastribosomalDNAgenesarelocatedonchromosomeXII.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.1979,76(1):410–414]，rDNA基因的转录开始于RNA聚合酶I在启动子位置与四个主要的转录因子即核心因子（CF）、Rrn3p、TATA结合蛋白（TBP）和上游激活因子复合物（UAF）形成起始复合物。细胞在核糖体生物合成中的能量投入大于对任何其它过程的投入。根据计算，在酵母标准生长的条件下，RNA聚合酶I介导的转录起始必须每5s发生一次[Reeder,R.H.,Lang,W.H.Terminatingtranscriptionineukaryotes:lessonslearnedfromRNApolymeraseI.TrendsBiochem.1997,Sci.22:473–477]。RNA聚合酶I以约60个核苷酸/秒延伸通过35SrRNA基因[FrenchSL,OsheimYN,CiociF,NomuraM,BeyerAL.InexponentiallygrowingSaccharomycescerevisiaecells,ribosomalRNAsynthesisisdeterminedbythesummedRNApolymeraseIloadingrateratherthanbythenumberofactivegenes.MolCellBiol.2003,23:1558–1568]。通过RNA聚合酶I介导rDNA转录在高的起始速率、聚合酶密度、在核仁内的特异性组织以及与核糖体组装的紧密连接等方面是独一无二的，占核内总转录的60％以上[WarnerJR.Theeconomicsofribosomebiosynthesisinyeast.TrendsBiochemSci.1999,24(11):437–440]。转录产物全长大概是6.7kb，也明显长于RNA聚合酶II和III介导的转录产物。RNA聚合酶I独特的转录起始和延伸效率比RNA聚合酶II和RNA聚合酶III都明显要快。利用RNA聚合酶I在rDNA基因转录方面的所起到高效作用这一特点，我们利用rDNA基因启动子启动外源或内源基因表达，构建了一种新型酿酒酵母表达体系。
技术实现思路
针对目前酵母表达体系存在的不足，利用RNA聚合酶I在rDNA基因转录方面的高效作用，用rDNA基因启动子启动外源或内源基因表达，构建了一种新型酿酒酵母表达体系。同时对于酿酒酵母中RNA聚合酶I介导的调控机制和rRNA合成机制的研究也具有重要的意义。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种新型酿酒酵母表达体系，由表达载体转染宿主构成，所述表达载体为环状，是构建于酿酒酵母和大肠杆菌间的穿梭质粒载体，该载体从5’到3’依次包括以下可操作性元件：YEplac195质粒骨架、外源或内源基因表达盒、筛选标记基因表达盒；所述YEplac195质粒是酵母附加体质粒，含有酵母2μ质粒的ori；所述外源或内源基因表达盒自上游至下游依次包括rDNA启动子、内部核糖体进入位点（Internalribosomeentrysite，IRES）序列、外源或内源基因表达框、poly(T)序列、rDNA终止子；所述筛选标记基因表达盒包括启动子、筛选标记基因、转录终止子。所述外源或内源基因表达盒中的基因开放阅读框为尿嘧啶基因或GFP基因，其中尿嘧啶基因开放阅读框来源于来源于酿酒酵母，序列如SEQIDNo:4所示。所述外源或内源基因表达盒中的rDNA启动子和rDNA终止子，序列分别如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示；所述外源或内源基因表达盒中的内部核糖体进入位点，序列如SEQIDNo:3所示；所述外源或内源基因表达盒中的poly(T)，序列如SEQIDNo:5所示。所述的筛选标记基因表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型酿酒酵母表达体系，由表达载体转染宿主构成，其特征在于，所述表达载体为环状，是构建于酿酒酵母和大肠杆菌间的穿梭质粒载体，该载体从5’到3’ 依次包括以下可操作性元件：YEplac195质粒骨架、外源或内源基因表达盒、筛选标记基因表达盒；所述YEplac195质粒是酵母附加体质粒，含有酵母2μ质粒的ori；所述外源或内源基因表达盒自上游至下游依次包括rDNA启动子、内部核糖体进入位点序列、外源或内源基因表达框、poly(T)序列、rDNA终止子；所述筛选标记基因表达盒包括启动子、筛选标记基因、转录终止子。

【技术特征摘要】
1.一种新型酿酒酵母表达体系，由表达载体转染宿主构成，其特征在于，所述表达载体为环状，是构建于酿酒酵母和大肠杆菌间的穿梭质粒载体，该载体从5’到3’依次包括以下可操作性元件：YEplac195质粒骨架、外源或内源基因表达盒、筛选标记基因表达盒；所述YEplac195质粒是酵母附加体质粒，含有酵母2μ质粒的ori；所述外源或内源基因表达盒自上游至下游依次包括rDNA启动子、内部核糖体进入位点序列、外源或内源基因表达框、poly(T)序列、rDNA终止子；所述筛选标记基因表达盒包括启动子、筛选标记基因、转录终止子。2.根据权利要求1所述的表达体系，其特征在于，所述外源或内源基因表达框中外源或内源基因为尿嘧啶基因或GFP基因。3.根据权利要求2所述的外源或内源基因，其特征在于，所述的尿嘧啶基因来源于酿酒酵母，序列如SEQIDNo:4所示。4.根据权利要求1所述的表达体系，其特征在于，所述外源或内源基因表达盒中的rDNA启动子和rDNA终止子，序列分别如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示；所述外源或内源基因表达盒中的内部核糖体进入位点序列，序列如SEQIDNo:3所示；所述外...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍晓明，徐丽丽，邱晨曦，李洪兴，易勇，张继祥，付传超，王栋，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，山东圣琪生物有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37