The present invention discloses a eukaryotic expression vector of VZV (varicella zoster virus) glycoprotein E gene and its recombinant yeast strain and its application. The carrier is a connection between the gE fusion gene and pPink HC, and the fusion gene of the alpha gE fusion group is due to the whole sequence of the gene of the VZV glycoprotein E and the fusion gene of the alpha signal peptide. The expression system of Pichia pastoris in the present invention can successfully express the glycoprotein E of varicella zoster virus, which lays the foundation for the subsequent immunogenicity detection and high expression in Pichia pastoris and the research and development of varicella zoster vaccine.
【技术实现步骤摘要】
VZV糖蛋白E基因表达载体及其重组酵母菌株与应用
本专利技术涉及基因工程领域,具体说,是涉及一种可用于表达VZV(水痘-带状疱疹病毒)糖蛋白E基因的表达载体及其重组酵母菌与应用。
技术介绍
水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus,VZV)是疱疹病毒属(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科成员,是一种直径150~200nm的DNA病毒,形态学上是由核酸内心、蛋白衣壳和包膜构成的同心圆状结构,表面由162各壳微粒组成的对称正二十面体,有嗜皮肤和神经的特征,在幼儿及老年人群中多发病的一种双链DNA病毒,是一种发病快、传染性高的疾病。它可引起水痘和带状疱疹两种常见病,还可引起脑炎、肺炎等严重并发症;而患者痊愈后少量残存的病毒潜伏于体内的神经细胞中,待机体免疫力低下时又会大量繁殖,从而导致疼痛性的疾病带状疱疹(herpeszoster)。在免疫受损的个体中,VZV感染的发病率和病死率都很高。VZV引起的疾病及其相关后遗症已逐渐成为重要的公共卫生问题,并日益受到人们的重视。VZV壳外有一层或多层的含脂蛋白的包膜,整个VZV基因组是一种包含有72个开放阅读框,约编码67种蛋白,能编码8种糖蛋白gE、gB、gH、gI、gC、gL、gK以及gM的序列,其中糖蛋白E(glycoproteinE,gE)是一种晚期结构蛋白,分子量较大,由ORF68基因编码,属于Ⅰ型膜蛋白,是生成感染性病毒颗粒的必需糖蛋白也是病毒在感染细胞中含量最高、抗原性最强的糖蛋白,广泛存在于在VZV颗粒的表面和宿主细胞的细胞膜和胞质中,病毒包膜上的含量最高,是被免疫系统识别的第 ...
【技术保护点】
1.VZV糖蛋白E基因表达载体,其特征在于:所述载体为α‑gE融合基因与pPink‑HC的连接体,其中α‑gE融合基因为VZV糖蛋白E的基因全序列和α信号肽的融合基因。
【技术特征摘要】
1.VZV糖蛋白E基因表达载体,其特征在于:所述载体为α-gE融合基因与pPink-HC的连接体,其中α-gE融合基因为VZV糖蛋白E的基因全序列和α信号肽的融合基因。2.根据权利要求1所述的表达载体,其特征在于:所述α-gE融合基因如SEQIDNO:6所示。3.用于表达VZV糖蛋白E基因的表达载体,其特征在于,所述表达载体通过如下方法构建:步骤A、设计引物,根据gE基因序列和pPink-HC上的多克隆位点序列分别设计引物,以实现在目标基因片段两端分别添加EcoRⅠ和SphⅠ酶切位点;步骤B、构建重组载体,将扩增后gE基因片段和pPink-HC经双酶切后连接,将连接产物经培养挑选阳性克隆子经测序鉴定正确后即得。4.根据权利要求4所述的表达载体,其特征在于,步骤A引物设计为:F引物5'端设有EcoRI酶切位点,R引物5'端设有SphⅠ酶切位点,且引物XF、XR进行PCR扩增α信号肽,GF、GR进行PCR扩增gE,X-GF、X-GR进行PCR扩增α-gE融合基因。5.VZV糖蛋白E基因表达载体,其特征在于,所述表达载体通过如下步骤获得:步骤a、根据如SEQIDNO:1所示的经密码子优化后的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的基因全序列、毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mix和/或α信号肽上的多克隆位点序列设计引物XF、XR、GF、GR、X-GF和X-GR,F引物5'端设有EcoRI酶切位点,R引物5'端设有SphⅠ酶切位点;引物XF、XR扩增α信号肽和GF、GR进行PCR扩增gE后,将所得PCR产物以gE片段和α信号肽片段为模板,引物X-GF、X-GR进行PCR扩增,PCR产物再经胶回收α-gE融合基因片段;步骤b、再将步骤a所得α-gE融合基因片段与pPink-HC分别扩增回收后,再分别用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切后回收酶切片段,将经酶切后的gE片段与pGAPZαA混合经T4连接酶连接得一连接产物,再将所得连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,再挑取阳性克隆子进行菌落PCR扩增,即得该重组表达载体;其中,引物XF序列如SEQIDNO:2所示,引物XR序列如SEQIDNO:3所示;引物GF序列如SEQIDNO:4所示,引物GR序列如SEQIDNO:5所示;引物X-GF序列如SEQIDNO:2所示,引物X-GR序列如SEQIDNO:3所示。6.一种VZV糖蛋白E基因表达载体的构建方法,其特征在于,具体包括如下步骤:步骤A、设计引物,根据gE和pPink-HC上的多克隆位点序列分别设计引物,以实现在目的片段两端分别添加EcoRⅠ和SphⅠ酶切位点...
【专利技术属性】
技术研发人员:肖杨,王雨,高媛,刘昊智,毛普加,幕婷,李津,吴克,
申请(专利权)人:武汉博沃生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:湖北,42
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