【技术实现步骤摘要】
重组乙肝表面抗原的生产方法
本专利技术属于蛋白药物生产领域，具体涉及一种重组乙肝表面抗原的生产方法。
技术介绍
据世界卫生组织报道，全球约20亿人感染HBV，每年约有65万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。20亿感染者中，约2.4亿人为慢性HBV感染，中国约占1/3(引自《世界卫生组织乙肝预防治疗指南》2015年版)。目前尚无特效药物用于治疗乙肝和HBV携带者，研制并应用乙肝疫苗来预防乙肝和治疗HBV携带者及乙肝病人有着重大意义。由于存在携带HIV等病毒及产量有限等问题，第一代血源性乙肝疫苗采用无症状乙肝病毒携带者血浆为原料，已经被世界卫生组织取缔，取而代之的是重组乙肝疫苗。目前在国内外流通的重组乙肝疫苗主要由中华地鼠卵巢细胞(CHO)、酿酒酵母菌、毕赤酵母菌及汉逊酵母菌作为生产宿主细胞生产。由于酵母菌来源的细胞具有高表达量、低成本等优势，目前在疫苗市场上已取得主导地位。与酿酒酵母菌相比，甲醇营养型的汉逊酵母表现出更高的表达量，没有过度糖基化的现象，并且能够耐受高温，最佳生长温度为37℃-43℃(Reindersetal.1999)。外源基因的整合多为非...
【技术保护点】
1.一种重组乙肝表面抗原的生产方法，该方法包括如下步骤：i)筛选乙肝表面抗原高拷贝、高蛋白表达的重组汉逊酵母菌株，包括以下步骤：1)构建用于表达重组乙肝表面抗原的载体；2)将步骤1)构建的载体转化入URA3营养缺陷型汉逊酵母菌株中，并在质粒转化的早期使用URA3基因突变互补和G418抗生素进行双向加压筛选；ii)高密度发酵生产重组乙肝表面抗原，包括如下步骤：1)甘油流加阶段，控制甘油流加速率在2g/min～10g/min；2)甲醇诱导阶段，通过甲醇电极将甲醇浓度控制在5.0±0.5g/L～8.0±0.5g/L范围内波动；3)甲醇诱导时间控制在40‑60小时，收集汉逊酵母细胞...
【技术特征摘要】
1.一种重组乙肝表面抗原的生产方法，该方法包括如下步骤：i)筛选乙肝表面抗原高拷贝、高蛋白表达的重组汉逊酵母菌株，包括以下步骤：1)构建用于表达重组乙肝表面抗原的载体；2)将步骤1)构建的载体转化入URA3营养缺陷型汉逊酵母菌株中，并在质粒转化的早期使用URA3基因突变互补和G418抗生素进行双向加压筛选；ii)高密度发酵生产重组乙肝表面抗原，包括如下步骤：1)甘油流加阶段，控制甘油流加速率在2g/min～10g/min；2)甲醇诱导阶段，通过甲醇电极将甲醇浓度控制在5.0±0.5g/L～8.0±0.5g/L范围内波动；3)甲醇诱导时间控制在40-60小时，收集汉逊酵母细胞，得到重组乙肝表面抗原。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述甘油流加阶段之前还包甘油初培养阶段，所述甘油初培养阶段使用BSM无机盐培养基，调整pH至5.0，温度37℃，通气量15.0～35.0L/min，控制溶氧在40％以上，罐压保持在0.5bar左右；所述BSM无机盐包含:0.90g/LCaSO4.2H2O、11.67g/LMgSO4.7H2O、14.67g/LK2SO4、9.00g/L(NH4)2SO4、50g/L甘油和25.05g/L六偏磷酸钠。3.根据权利要求2所述的方法，其中，在所述甘油初培养阶段之前还包括将所述重组汉逊酵母菌株制成种子液的步骤。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在所述甘油流加阶段中，当溶氧快速上升时，开始补加甘油，甘油流加速率为2.0g/min～10.0g/min，当湿菌重升至250～300g/L，停止甘油流加，待溶氧再次快速上升时，饥饿半小时后，开始甲醇诱导。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，在所述甲醇诱导阶段中，调整pH至5.0，温度30℃，通气量15.0～35.0L/min，控制溶氧在20％以上，罐压保持在0.5bar左右，甲醇浓度控制在5.0±0.5g/L～8.0±0.5g/L；优选地，甲醇浓度在4.5-8.3g/L范围内波动；更优选地，甲醇浓度在4.6-5.8g/L范围内波动；最优选地，甲醇浓度在5.0-6.5g/L范围内波动。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，该方法还包括如下步骤：1)菌体破碎：取根据权利要求1-5任一项的方法发酵得到...
【专利技术属性】
技术研发人员：李建强，任苏林，孙洪林，周童，顾月，葛君，戚凤春，鲍梦汝，韩杰，陈晓晓，
申请(专利权)人：南京赛威信生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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