一种多聚半乳糖醛酸酶突变体TePG28b_△S88及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及农业生物技术领域，具体地，本发明专利技术涉及一种多聚半乳糖醛酸酶突变体TePG28b_△S88及其基因和应用。通过去除氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多聚半乳糖醛酸酶的第88位的丝氨酸而获得所述突变体。本发明专利技术提供的多聚半乳糖醛酸酶突变体催化效率高，在此改造条件下，突变体对多聚半乳糖醛酸的Kcat/Km比野生型提高，突变体ΔS88的Kcat/Km提高了1.17倍，酶促反应最适温度与野生型保持不变，但是突变体N85E/S86W最适pH向右偏移了一个单位，其他突变体pH不变。

Polygalacturonase mutant TePG28b_ Delta S88 and its gene and Application

The invention relates to the field of agricultural biotechnology. In particular, the invention relates to a polygalacturonase mutant TePG28b_ S88 and its genes and applications. The mutant was obtained by removing amino acid sequence, such as the eighty-eighth position serine of polygalacturonase expressed in SEQ ID NO.1. The polygalacturonase mutants provided by the present invention have high catalytic efficiency. Under the conditions, the mutants increase the Kcat/Km of polygalacturonic acid more than the wild type, the Kcat/Km of the mutant Delta S88 is 1.17 times higher and the optimum temperature of the enzyme reaction remains unchanged with the wild type, but the optimum pH of the mutant N85E/S86W is shifted to the right. One unit, other mutants pH invariable.

【技术实现步骤摘要】
一种多聚半乳糖醛酸酶突变体TePG28b_△S88及其基因和应用
本专利技术涉及农业生物
，具体地，本专利技术涉及一种多聚半乳糖醛酸酶突变体TePG28b_△S88及其基因和应用。
技术介绍
果胶(pectin)是甲酯化的多聚半乳糖醛酸物质，分子中约75％羧基是甲酯化的。水解酶类的多聚半乳糖醛酸酶是目前市场上研究最多，应用最广泛的一种商业果胶酶。果胶酶对果胶的降解对于各种工业应用具有重要的商业重要性，包括食品，饲料，造纸，纺织，燃料和化学品，并且，果胶酶可用于生产果胶寡糖，这对减少重金属造成的损害和抗肥胖和抗氧化作用有重要的作用。因此开发、挖掘和改良以获取更优质的果胶酶资源具有很大的经济意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体，将野生型T3loop区上第88位的丝氨酸截掉的突变体。本专利技术的再一目的是提供编码上述突变体的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株。根据本专利技术的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体，其母本多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，将野生型T3loop区上第88位的丝氨酸截掉的突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.1：1MRSFTQVLSFLLPAVSAAVAGKKGPGDNSECVATEYSQVPTLAACTNVV51LRDIAVPSNSALDLTSAKDNSVITFEGTTTFGFTNSSSFNPILLSGNNIT101ITGAPGSVIDGNGQLYWDGLGSNGGVPKPDHFVYIKKLNKGSVIENLHIR151NWPVHCFSINSCSDLTIRNLFLDNSAGNAPNNRSNGLAAAHNSDGFDIST201STNVVVKDTTVINQDDCVAVTSGDQITATGLTCIGGHGLSIGSVGGKSAN251NVTNVIFSKSAVIDSQNGARIKTNYGTTGFVANITYEDILLHNISIYGLD301VQQDYLNGGPTGTPTNGVIIENLLFKNLVGTMAKNSNARDYYILCGNGSC351SNFVFENVHIVGGESASSCNYPASGCP*SEQIDNO.2：1MRSFTQVLSFLLPAVSAAVAGKKGPGDNSECVATEYSQVVPTLAACTNVV51LRDIAVPSNSALDLTSAKDNSVITFEGTTTFGFTNSSFNPILLSGNNITI101TGAPGSVIDGNGQLYWDGLGSNGGVPKPDHFVYIKKLNKGSVIENLHIRN151WPVHCFSINSCSDLTIRNLFLDNSAGNAPNNRSNGLAAAHNSDGFDISTS201TNVVVKDTTVINQDDCVAVTSGDQITATGLTCIGGHGLSIGSVGGKSANN251VTNVIFSKSAVIDSQNGARIKTNYGTTGFVANITYEDILLHNISIYGLDV301QQDYLNGGPTGTPTNGVIIENLLFKNLVGTMAKNSNARDYYILCGNGSCS351NFVFENVHIVGGESASSCNYPASGCP*本专利技术还提供了编码上述突变体的基因。本专利技术还提供了包含上述突变体基因的重组载体。本专利技术还挺了包含上述突变体基因的重组质粒。本专利技术还提供了一种制备高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的方法，包括以下步骤：1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；3)回收并纯化所表达的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶ΔS88A；本专利技术提供的多聚半乳糖醛酸酶突变体催化效率高，在此改造条件下，突变体对多聚半乳糖醛酸的Kcat/Km比野生型提高，突变体ΔS88的Kcat/Km提高了1.17倍，酶促反应最适温度与野生型保持不变，但是突变体N85E/S86W最适pH向右偏移了一个单位，其他突变体pH不变。本专利技术还提供了上述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的应用。运用基因工程手段来产业化生产多聚半乳糖醛酸酶，可作应用于饲料、食品、纺织等工业。附图说明图1显示高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体与母本野生型的最适温度。图2显示高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体与母本野生型的最适pH。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株：PichiapastorisGS11，载体：pPIC9r。2产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L(NH4)SO4，1g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.01g/LFeSO4·7H2O，0.2g/LCaCl2于1L去离子水中，121℃条件下灭菌处理20min(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCI，pH7.0)。(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖(3)MD固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin(4)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。(5)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。实施例1高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体编码基因ΔS88的克隆以T.leycettanusJCM12802克隆的基因TePG28b的重组质粒pPIC9r-TePG28b为模板，设计引物，然后进行扩增表1.高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体所用特异性引物实施例2高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的制备。对重组质粒pPIC9r-amy6进行特异性点突变扩增获得高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体质粒pPIC9r-ΔS88并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115-ΔS88。取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mLBMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体最适温度为70℃，较野生型相比，没有发生改变，最适pH均为3.5，与野生型相保持一致。突变体对多聚半乳糖醛酸的Kcat/Km比野生型都提高，ΔS88的Kcat/Km提高了1.17倍。实施例3重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型的活性分析一、采用DNS法都该专利技术的多聚半乳糖醛酸酶进行活性分析。具体方法如下：在给定的pH、温度条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应30min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。淀粉酶活性单位定义：在70℃，pH3.5条件下，每分钟内催化水解底物释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。二、重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型的性质测定1、重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和母本野生型的最适温度测定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高温高比活的多聚半乳糖醛酸酶突变体TePG28b_△S88，其特征在于，通过去除氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多聚半乳糖醛酸酶的第88位的丝氨酸而获得所述突变体。

【技术特征摘要】
1.一种高温高比活的多聚半乳糖醛酸酶突变体TePG28b_△S88，其特征在于，通过去除氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多聚半乳糖醛酸酶的第88位的丝氨酸而获得所述突变体。2.高温高比活的多聚半乳糖醛酸酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的高温高比活的多聚半乳糖醛酸酶突变体TePG28b_△S88。3.包含权利要求2所述高温高比活的多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体。4.包含权利要求2所述高温高比活的多聚半乳糖醛酸酶突变体...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，涂涛，罗会颖，王亚茹，黄火清，王苑，柏映国，苏小运，孟昆，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11