一种新型鞘糖脂内切糖苷酶及其基因工程制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及了一种可实现鞘糖脂内切糖苷酶EGCase I工程化表达的方法，可以有效地将EGCase I可溶性地表达，并保持有优秀的水解以及转糖苷活性；并在此基础上，进一步开发出了一种新型的EGCase I突变酶，既具有较宽的底物谱，又兼具糖苷合成酶活性；所获得的鞘糖脂内切糖苷酶非常适合应用于工业化鞘糖脂的分析与合成中。

A new glycosaminoglycan endoglycosidase and its genetic engineering preparation method and Application

The invention relates to a method for engineering expression of the glycolipid glucosidase EGCase I, which can effectively express EGCase I soluble and maintain excellent hydrolysis and glucoside activity. On the basis of this, a new EGCase I mutant enzyme has been developed, which has a wide substrate spectrum. The glycosidic endoglycosidase obtained from the glycosaminoglycan is very suitable for the analysis and synthesis of glycosaminoglycan.

【技术实现步骤摘要】
一种新型鞘糖脂内切糖苷酶及其基因工程制备方法和应用
本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及一种鞘糖脂内切糖苷酶及其基因工程制备方法，以及在鞘糖脂分析与合成中的应用。
技术介绍
鞘糖脂(Glycosphingolipid,GSL)是真核细胞细胞膜的组成成分，是一类由神经酰胺和寡糖链以糖苷键结合形成的双亲分子。研究表明，鞘糖脂参与多种生理过程，包括信号传导、细胞免疫以及大脑发育等。此外鞘糖脂还与一些病理过程相关，包括病原入侵、癌症发生以及胰岛素抗性等。由于鞘糖脂结构复杂，其来源主要依靠天然提取，然而提取过程中需要大量使用丙酮、氯仿和甲醇等有机溶剂，污染环境、成本高昂且收率较低；而化学合成方法步骤复杂、人力耗费大、成本较高，同时也存在产率低污染环境的问题。因此大大地制约了鞘糖脂大规模的工业化生产。鞘糖脂内切糖苷酶(Endoglycoceramidase，EGCase，EC3.2.1.123)是属于糖苷水解酶家族5的一类内切酶，能够水解鞘糖脂的寡糖链与神经酰胺之间的β-糖苷键，生成完整的寡糖链和神经酰胺，基于此该酶可用于胞内鞘糖脂分析。1989年Ito课题组在Rhodococc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鞘糖脂内切糖苷酶，其特征在于，所述鞘糖脂内切糖苷酶与SEQ ID NO:2的序列一致性不低于85％，且第339位或其对应位点发生突变，所述突变为第339位的谷氨酸被甲硫氨酸所取代。

【技术特征摘要】
1.一种鞘糖脂内切糖苷酶，其特征在于，所述鞘糖脂内切糖苷酶与SEQIDNO:2的序列一致性不低于85％，且第339位或其对应位点发生突变，所述突变为第339位的谷氨酸被甲硫氨酸所取代。2.一种多核苷酸，编码一种鞘糖脂内切糖苷酶，其特征在于：所述的多核苷酸编码如权利要求1所述的一种鞘糖脂内切糖苷酶或与SEQIDNO:1的序列一致性不低于80％。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述的多核苷酸。4.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞包含权利要求3所述的表达载体，或者其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。5.一种可基因工程化表达鞘糖脂内切糖苷酶的方法，其特征在于，将权利要求2所述的多核苷酸插入到权利要求3所述的表达载体中，再整合至权利要求4所述的基因工程化细胞中进行培养和表达，最终可在胞内或胞外获得可溶性的鞘糖脂内切糖苷酶。6.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨广宇，韩云宾，冯雁，李卓，刘桂祯，陈柳青，谭玉萌，
申请(专利权)人：上海交通大学，开平牵牛生化制药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31