用于检测遗传性耳聋的PNA探针以及使用所述探针检测遗传性耳聋的方法技术

本发明专利技术涉及用于检测遗传性耳聋的肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)探针，以及一种使用所述探针检测遗传性耳聋的方法。使用本发明专利技术的用于检测遗传性耳聋的PNA探针以及使用所述探针检测遗传性耳聋的方法，可有望简单快捷地检测出与耳聋相关的基因以及其突变体，并且可用于诊断早期遗传性耳聋及其危险性(使用GJB2、SLC26A4、12S rRNA、CDH23 TMPRSS3基因的11个突变体，其为遗传性耳聋的主要成因)。

PNA probe for detecting hereditary deafness and method for detecting hereditary deafness using the probe

The present invention relates to a peptide nucleic acid (Peptide Nucleic Acid, PNA) probe for detecting hereditary deafness, and a method for detecting hereditary deafness by using the probe. Using the PNA probe for detecting hereditary deafness and the method of detecting hereditary deafness by using the probe, it is possible to detect the genes associated with deafness and its mutants simply and quickly, and can be used to diagnose early hereditary deafness and its risk (making use of GJB2, SLC26A4, 12S rRNA, CDH23 TMPRSS3. The 11 mutation of the gene is the main cause of hereditary deafness.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测遗传性耳聋的PNA探针以及使用所述探针检测遗传性耳聋的方法
本专利技术涉及用于检测遗传性耳聋的肽核酸(PeptideNucleicAcid,PNA)探针以及使用所述探针检测遗传性耳聋的方法。
技术介绍
耳聋是迄今为止发现的新生儿先天性疾病中患病率较高的疾病之一。根据有关报道，在每一千名出生的婴儿之中，就有0.9名到5.9名婴儿患有耳聋。虽然新生儿耳聋患者较多，但由于出生时没有被及时发现，有很多婴儿直到两岁以后才被发现并确诊为耳聋。新生儿出生后的前三年是语言能力发展的重要时期，因此如果耳聋在两岁之前未被及时发现并治疗，那么除了在语言康复上会产生困难，耳聋还会留下后遗症，导致终身残疾。因此，为了预防耳聋，有必要对新生儿进行听力筛查测验以便及早发现婴儿或儿童的听力受损(如遗传性耳聋)并进行适当的康复治疗。另一方面，目前是使用自动听性脑干反应测试(AABR)和自动耳声发射(AOAE)等仪器进行新生儿听力筛查测验。然而通过这些仪器进行的体格检查只在诊断先天性耳聋时有效，其缺点是无法诊断非综合征性先天性耳聋。因此，为了诊断非综合征性先天性耳聋，有必须要对新生儿的基因进行检测。目前为止，基因突变的检测方法包括对聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)产物的直接测序分析(Directsequencing)、限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析、线性探针分析(LineProbeassay)、限制性片段质量多态性分析(PCR-RFMP)分析以及多重PCR(multiplexPCR)方法和DNA芯片检测法。遗传性耳聋的检测方法主要是通过DNA芯片(chip)或者PCR进行DNA测序，然而DNA芯片有其局限性，即：如果发现新的变异，就要重新制作芯片。因此，这就需要使用诸如大韩民国公开专利公报第2012-0067384号所登记的那种能够低廉且准确诊断遗传性耳聋的技术。最近，使用探针的检测方法因其灵敏度(sensitivity)和特异性(specificity)较高而受人瞩目，但使用设计复杂的探针进行检测价格高昂且使用上也非常不便。因此，迫切需要开发出一种设计简单、能够迅速检测且精度较高的技术。专利技术的详细说明技术问题为了解决上述问题，本专利技术提供了一种用于检测遗传性耳聋的PNA探针和引物对(primerpair)。同时，本专利技术还提供了利用所述的PNA探针和所述的引物对从扩增并杂交的样本中检测与耳聋相关的基因突变的方法。技术方案依据本专利技术的一个方面，提供了一种用于检测遗传性耳聋的肽核酸(PNA)探针，其包括：任一选自由SEQIDNO:1～11组成的群组的序列。依据本专利技术的另一个方面，提供了一种用于检测遗传性耳聋的引物对，所述的引物对选自由SEQIDNO:12～31组成的群组，所述的引物对为：作为正向引物、序列如SEQIDNO:12所示的核苷酸序列，作为反向引物、序列如SEQIDNO:13所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:14所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:15所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:16所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:17所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:18所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:19所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:20所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:21所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:22所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:23所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:24所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:25所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:26所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:27所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:28所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:29所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:30所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:31所示的核苷酸序列。依据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供一种用于检测遗传性耳聋的组合物，其包含上述PNA探针和上述引物对。依据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了一种检测遗传性耳聋的方法，所述的方法包括以下几个步骤：a)从样本中提取gDNA；b)利用能够扩增基因或其突变体的正向和反向引物扩增所述的基因或其突变体，并与能够与所述的基因或其突变体杂交的PNA探针杂交，所述的基因选自由GJB2、SLC26A4、12SrRNA、CDH23和TMPRSS3组成的群组；c)分析上述步骤b)得到的杂交反应物的解链曲线以检测所述的基因或其突变体。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：使用本专利技术的用于检测遗传性耳聋的PNA探针以及使用所述探针检测遗传性耳聋的方法，可有望快速且容易地检测出与耳聋相关的基因或其突变体，并且可用于诊断早期遗传性耳聋、非综合征性耳聋及其患病风险(利用GJB2、SLC26A4、12SrRNA、CDH23TMPRSS3基因的11个突变体，其为遗传性耳聋的主要成因)。附图说明图1为检测遗传性耳聋时扩增和PNAFMCA的PCR条件。图2为耳聋相关基因的野生型(wild-type)和突变体的解链曲线。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本专利技术的术语“探针”是指与基因或mRNA形成特异结合的短至几个、长至数百个碱基的RNA或DNA等核酸片段，可以以寡核苷酸(oligonucleotide)探针、单链DNA(singlestrandedDNA)探针、双链DNA(doublestrandedDNA)探针、RNA探针等形式制备，为了便于检测也可以被标记，但不限于此类。本专利技术的“杂交”是指互补的单链核酸形成双链核酸。当两条核酸链完全匹配(perfectmatch)时可以发生杂交，或者即使存在一些错配(mismatch)碱基存在，杂交也有可能发生。杂交所需的互补程度根据杂交的条件变化，尤其是可以通过温度来控制。本专利技术的“核酸”是指待检测的核酸序列，在杂交、退火或扩增条件下与引物或探针退火或杂交。本专利技术涉及用于检测遗传性耳聋的PNA探针，所述的探针包括选自由SEQIDNO:1～11所示的序列组成的群组中的任一条。PNA(肽核酸,PeptideNucleicAcid)是一种基因识别材料，如锁核酸(Lockednucleicacid,LNA)和吗啉代核酸(Mopholinonucleicacid，MNA)，其是人工合成的，基本结构由聚酰胺组成。PNA具有非常高的亲和力(affinity)和选择性(selectivity)，并且对核酸酶高度稳定，因此不会被现有的限制性内切酶(restrictionenzyme)降解。此外，由于它在热度/化学性质方面具有稳定性，因而具有容易储存并且不易分解的优点。另外，PNA-DNA结合力优于DNA-D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测遗传性耳聋的肽核酸(PNA)探针，其包括：任一选自由SEQ ID NO:1～11组成的群组的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.26 KR 10-2015-01662521.一种用于检测遗传性耳聋的肽核酸(PNA)探针，其包括：任一选自由SEQIDNO:1～11组成的群组的序列。2.如权利要求1所述的用于检测遗传性耳聋的肽核酸(PNA)探针，所述的PNA探针与选自由GJB2、SLC26A4、12SrRNA、CDH23和TMPRSS3组成的群组中的任一种基因杂交。3.如权利要求1所述的用于检测遗传性耳聋的肽核酸(PNA)探针，所述的PNA探针与选自由GJB2基因的V37I、235delC、299-300delAT和R143W，SLC26A4基因的T410M、L676Q、H723R和IVS7-2A>G，12SrRNA基因的1555A>G、CDH23基因的P240L以及TMPRSS3基因的A306T组成的群组中的任一种基因突变体杂交。4.如权利要求1所述的用于检测遗传性耳聋的肽核酸(PNA)探针，所述的述PNA探针与报告因子或猝灭剂结合。5.一种用于检测遗传性耳聋的引物对，所述的引物对选自由SEQIDNO:12～31组成的群组，所述的引物对为：作为正向引物、如SEQIDNO:12所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:13所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:14所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:15所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:16所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:17所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:18所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:19所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:20所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:21所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:22所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:23所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:24所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:25所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:26所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:27所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:28所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:29所示的核苷酸序列；作为正向引物、如SEQIDNO:30所示的核苷酸序列，作为反向引物、如SEQIDNO:31所示的核苷酸序列。6.一种用于检测遗传性耳聋的组合物，其包含如权利要求1～4项任一项所述的PNA探针和权利要求5所述的引物对。7.一种检测遗传性耳聋的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋民植，朴希卿，金敬卓，
申请(专利权)人：海阳生物材料有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR