检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒，其中检测非缺失型α地贫基因突变的探针，所述探针包括：用于检测αWS和αQS位点的探针ααT‑P1；用于检测αCS位点的探针ααT‑P2；用于检测CD30和CD31位点的探针ααT‑P3；用于检测CD13位点的探针ααT‑P4；用于检测CD59位点的探针ααT‑P5。本发明专利技术可实现一次同时检测7种非缺失型α‑地贫基因突变，与同类产品相比，检测位点更全面，检测时间更短，效率更高。

Probes, primers and kits for detection of gene mutations in non deficient alpha thalassemia

The invention relates to a probe, primer and kit for detecting the mutation of the non missing alpha ground poor gene, in which a probe for detecting the mutation of the non missing alpha ground poor gene is detected. The probe includes: a probe alpha alpha T P1 for detecting alpha WS and alpha QS loci; a probe alpha alpha T P2 for detection of the alpha CS site; for detection of CD30 and CD31 loci. Needle alpha alpha T P3; probe CD13 alpha for probe CD13 alpha T P4; for detecting CD59 site probe alpha alpha T P5. The invention can simultaneously detect 7 kinds of non missing gene mutations in the poor gene. Compared with the similar products, the detection loci are more comprehensive, the detection time is shorter, and the efficiency is higher.

【技术实现步骤摘要】
检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒
本专利技术涉及基因检测技术，特别涉及一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒。
技术介绍
人类α-珠蛋白基因簇位于16号染色体上，表达α珠蛋白链与β珠蛋白链结合，形成具有功能血红蛋白四聚体。正常情况下，人类珠蛋白基因所表达的α类和β类珠蛋白链比例适当(1:1)，当α珠蛋白基因缺陷，导致α链合成减少而β链相对过剩，即可导致α-地中海贫血疾病。α-地中海贫血包括缺失型α-地中海贫血与非缺失型α-地中海贫血。非缺失型α-地贫，其基因突变大多数发生在1个基因(α2或α1)上，不会使另一个α-基因功能受损，所以定义为α+-地贫，即为αTα/或ααT/。其杂合子既有静止型α-地贫表型(HbWestmead，即αWSα/)，也有轻型α-地贫表型(如αCSα/和αQSα/)。在正常情况下，α2较α1基因的功能强，表达量也较α1基因大，α2约占基因表达量的2/3，α1约占基因表达量的1/3；因此当发生基因突变时，α2基因的突变一般会比α1基因突变降低基因产物的作用更大。当α2基因发生非缺失型突变时，α-链的产量比α2基因发生缺失时明显减少。因此，有些非缺失型α-地贫的纯合子可以表现为血红蛋白H病，即HbH病，同样，部分点突变导致的α-地中海贫血如HbCS和HbQS杂合子合并轻型α-地中海贫血(--/αα)可使患者表型加重，即(--/αCSα)和(--/αQSα)可能比(--/-α)临床表现更为严重。中国南方非缺失型α-地贫的发病率较高，常见基因型为αCSα、αQSα和αWSα。其中αCSα/在泰国人群中的基因频率达4％，是东南亚地区最常见的非缺失型。αWSα/是最常见的非缺失型α-地中海贫血，在广西地区的发生率约为1.55％，αCSα/和αQSα/次之，分别为1.21％和0.36％。此外，中国人群中还报道了CD30(-GAG)、CD31(AGG>AAG)、CD13(GCC>TCC)和CD59(GGC>GAC)等变异类型。由于以上非缺失型α都是发生在α2基因上的突变，因此临床检测意义更为重要，在本专利中，我们检测7种类型的α点突变，涵盖了约90％以上的非缺失型α地贫类型，上述7种类型的α点突变的位点名称依次为CD122、CD142、CD125、CD30、CD31、CD13、CD59，其检测的突变类型依次对应为CAC→CAG(α2基因)、TAA→CAA(α2基因)、CTG→CCG(α2基因)、-GAG(α2基因)、AGG→AAG(α2基因)、GCC→TCC(α2基因)、GGC→GAC(α2基因)，其位点简称依次对应为WSM、CSM、QSM、30M、31M、13M、59M。目前对于地贫尚无理想的治疗方法，而地贫携带者又多无症状而不易察觉，因此降低其发生率的有效方法是对高发地区的婚孕人群广泛开展地贫基因筛查，若检出高危人群即患者或者携带者则应进行产前诊断，产前诊断可预防重型和中间型地贫患儿出生，对于优生优育和提高国民身体素质有着重要的意义。目前常见的非缺失型α地贫基因检测方法有：1、扩增阻碍突变系统PCR(ARMS-PCR)，是分别针对每一个突变位点，采用两个PCR反应管逐一检测，操作繁琐、费时费力，并且这种技术的检测条件难以控制，易于出现假阴性和假阳性结果。2、等位基因特异性寡核苷酸杂交法(ASO)，可减少假阴性和假阳性结果，但仍需逐一检测每一个突变位点，检测通量低，费时费力。3、PCR-反向点杂交(PCR-ReverseDotBlot，PCR-RDB)法：这一方法具有灵敏度高、特异性好和通量高等优点，可同时检测WS、QS和CS三种突变类型，目前已广泛应用于α-地贫的临床基因诊断，但其人工操作繁琐，先进行PCR扩增α2珠蛋白基因，然后再通过变性、杂交、洗膜、显色等一系列操作再观察检测结果，检测时间较长，降低了工作效率。同时，PCR产物的开盖操作也大大增加了实验室携带污染的风险。4、DNA测序：此技术操作过程是先PCR扩增，再PCR产物纯化、测序PCR反应、测序仪上毛细管电泳分析等，同样存在操作繁琐、携带污染等问题。目前市场上生产厂家主要有：亚能生物技术(深圳)有限公司、深圳益生堂生物企业有限公司、中山大学达安基因股份有限公司和潮州凯普生物化学有限公司等。国内主要产品(包括产品名称、生产厂家、注册证号)为：1、《地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)》，亚能生物，国食药监械(准)字2015第3401272；2、《α-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)》，凯普生物，国械注准20153400437；3、《α-和β-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+膜杂交法)》，凯普生物，国食药监械(准)字2015第3401664号；4、《非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒》，厦门致善，国食药监械(准)字2014第3401352号；5、《非缺失型α地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)》，深圳益生堂，国械注准20143402140；6、《非缺失型α-地中海贫血点突变基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)》，中山大学达安基因，国械注准20153401298；7、《地中海贫血((α/β型))基因检测试剂盒》，中山大学达安基因，国械注准20153401068。上述产品中，深圳益生堂的非缺失型α地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)及达安基因的非缺失型α-地中海贫血点突变基因检测试剂盒，它们采用的技术均为PCR-反向点杂交技术，虽然其通量较高，特异性好，但人工操作繁琐耗时，检测时间长，难以实现自动化，并且扩增结束之后的开盖操作易污染。厦门致善生物的非缺失型α地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-熔解曲线技术)，其只检测常见的三种点突变(αCS、αQS、αWS)，检测位点少，灵敏度也不够高。
技术实现思路
针对上述，本专利技术解决的技术问题为：提供一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒，可解决上述检测时间长、位点少和灵敏度不高的问题。一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针，所述探针包括：用于检测αWS和αQS位点的探针ααT-P1，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；用于检测αCS位点的探针ααT-P2，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；用于检测CD30和CD31位点的探针ααT-P3，其核苷酸序列为如SEQIDNo.3所示；用于检测CD13位点的探针ααT-P4，其核苷酸序列为如SEQIDNo.4所示；用于检测CD59位点的探针ααT-P5，其核苷酸序列为如SEQIDNo.5所示。一种检测非缺失型α地贫基因突变的引物，所述引物包括：用于检测αWS、αQS和αCS位点的上游引物αT-F和下游引物αT-R，其核苷酸序列如SEQIDNo.7-8所示；用于检测CD13、CD30、CD31和CD59位点的上游引物αB-F和下游引物αB-R，其核苷酸序列如SEQIDNo.9-10所示。一种检测非缺失型α地贫基因突变的试剂盒，包括反应液，所述反应液包括上述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针以及上述的检测非缺失型α地贫基因突变的引物。本专利技术的技术效果为：本专利技术的检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒，设计上述SEQIDNo.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，所述探针包括：用于检测αWS和αQS位点的探针ααT‑P1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；用于检测αCS位点的探针ααT‑P2，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；用于检测CD30和CD31位点的探针ααT‑P3，其核苷酸序列为如SEQ ID No.3所示；用于检测CD13位点的探针ααT‑P4，其核苷酸序列为如SEQ ID No.4所示；用于检测CD59位点的探针ααT‑P5，其核苷酸序列为如SEQ ID No.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，所述探针包括：用于检测αWS和αQS位点的探针ααT-P1，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；用于检测αCS位点的探针ααT-P2，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；用于检测CD30和CD31位点的探针ααT-P3，其核苷酸序列为如SEQIDNo.3所示；用于检测CD13位点的探针ααT-P4，其核苷酸序列为如SEQIDNo.4所示；用于检测CD59位点的探针ααT-P5，其核苷酸序列为如SEQIDNo.5所示。2.根据权利要求1所述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，还包括内参探针β-actin-P，其核苷酸序列为如SEQIDNo.6所示。3.根据权利要求1所述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。4.根据权利要求1所述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，所述探针中至少一条探针序列的碱基的3’端进行肽核酸修饰，所述探针中至少一条探针序列的碱基的5’端进行硫代磷酸化修饰。5.根据权利要求4所述的检测非缺失型α地贫基因突变的探针，其特征在于，对探针ααT-P1、探针ααT-P2、探针ααT-P3、探针ααT-P4和探针ααT-P5中至少一条进行所述肽核酸修饰和/或硫代磷酸化修饰，修饰后的核苷酸序列为：SEQIDNo.1为：5’-TGCACGCCTCCCTGGACAAT-3’；SEQIDNo.2为：5’-A+CCGTTAAGCTGGAGACT-3’；SEQIDNo.3为：5’-C+CCTGGAGAGGTGAGGCTAC-3’；SEQIDNo.4为：5’-TACCCCAGGCGGCCTTTAT-3’；以及SEQIDNo.5为：5’-CCGACCCGGGCTCCTC-3’。6.一种检测非缺...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲玲，陈永娟，田洁，
申请(专利权)人：亚能生物技术深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44