一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因疫苗技术领域，具体涉及一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗，包括如下步骤，S1、设计疫苗靶点OVepis基因；S2、将S1中设计的疫苗靶点OVepis基因插入免疫载体草鱼CD74蛋白编码基因中II类分子相关肽段区的第261～280bp之间，方向从序列5’端到3’端，形成一个大小为1020bp的CD74(1‑261bp)‑Ovepis‑CD74(280‑711bp)嵌合基因，再用靶向递送载体大肠杆菌DH5α冻干菌蜕装载上述嵌合基因，即获得所述靶向表位基因疫苗；所述嵌合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。本发明专利技术有益效果是：本发明专利技术的这种口服靶向表位基因疫苗不仅能防止体内核酸酶的降解、增加疫苗DNA编码基因在黏膜局部抗原呈递细胞内的表达，又可将表达和加工处理后的抗原肽高效呈递给T、B细胞，从而大大提高所述疫苗的免疫效果。

A Vibrio parahaemolyticus oral targeted epitope gene vaccine and its preparation method and Application

The present invention belongs to the technical field of gene vaccine, in particular to an orally targeted epitope gene vaccine of Vibrio mimicus, including the following steps, S1, the design of the OVepis gene of the vaccine target, S2, the insertion of the OVepis gene of the vaccine target in the S1 of the immune carrier, 261st to 28 of the II molecular related peptide segment region of the immune vector of the grass carp CD74 protein. Between 0bp, the direction from the 5 'end to the 3' end, forming a 1020bp CD74 (1 261bp) Ovepis CD74 (280 711bp) chimeric gene, and then the target delivery carrier, Escherichia coli DH5 alpha, loaded with the above chimeric gene, that is, the target epitope is obtained, and the nucleotide sequence of the chimeric gene is such as SE. Q ID NO:20 shows. The beneficial effect of the invention is that the oral target epitope gene vaccine of the invention can not only prevent the degradation of the nuclease in the body, increase the expression of the vaccine DNA encoding gene in the local antigen presenting cell of the mucous membrane, but also efficiently deliver the expressed and processed antigen peptides to the T and B cells, thus greatly improving the vaccine. Immune effect.

【技术实现步骤摘要】
一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于基因疫苗
，具体涉及一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
拟态弧菌(Vibriomimicus)是一种严重危害水产养殖业健康发展的肠道病原菌。该菌主要经消化道黏膜感染鱼体，引起养殖鱼类腹水病。口服疫苗诱导的肠黏膜免疫应答在预防拟态弧菌引起的鱼类腹水病中发挥着至关重要的作用，也是水产养殖生产中最实用的疫苗剂型。表位基因疫苗是将保护性抗原表位基因克隆至真核表达元件下游构成的真核表达重组质粒。该疫苗进入体内后，通过宿主细胞的转录翻译系统持续表达抗原蛋白，诱导宿主产生全面且持久的免疫应答，从而达到防治传染病的目的。然而，“裸”表位基因疫苗以口服方式进入鱼体后，易受到消化道环境中核酸酶降解，同时由于基因疫苗表面带负电，也限制了其与肠黏膜局部抗原递呈细胞膜接触而内化，使其免疫原性下降，因此“裸”表位基因疫苗不能直接用于口服免疫。故亟须研发一种既能克服核酸酶降解，又能靶向局部抗原递呈细胞和促进抗原递呈的拟态弧菌靶向表位基因疫苗。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗，既能克服核酸酶降解，又能靶向局部抗原递呈细胞和促进抗原递呈。本专利技术提供了一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗，包括如下步骤，S1、构建疫苗靶点OVepis基因；S2、将S1中设计的疫苗靶点OVepis基因插入免疫载体草鱼CD74蛋白编码基因中II类分子相关肽段区的第261～280bp之间，方向从序列5’端到3’端，形成一个大小为1020bp的CD74(1-261bp)-Ovepis-CD74(280-711bp)嵌合基因，再用靶向递送载体大肠杆菌DH5α冻干菌蜕装载上述嵌合基因，即获得所述靶向表位基因疫苗；所述嵌合基因的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。优选的，所述S1中，构建疫苗靶点OVepis基因的具体方法如下：使用具有接头肽“丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸”的核苷酸序列SEQIDNO:8、具有接头肽“甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸”的核苷酸序列SEQIDNO:9以及具有接头肽“甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸”的核苷酸序列SEQIDNO:10，将拟态弧菌黏附素蛋白OmpU的2个B细胞线性表位的核苷酸序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，拟态弧菌溶血素蛋白VMH的3个B细胞线性表位的核苷酸序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和拟态弧菌溶血素蛋白VMH的2个模拟表位的核苷酸序列SEQIDNO:6、SEQIDNO:7按照SEQIDNO:1-SEQIDNO:8-SEQIDNO:2-SEQIDNO:8-SEQIDNO:3-SEQIDNO:8-SEQIDNO:4-SEQIDNO:8-SEQIDNO:5-SEQIDNO:9-SEQIDNO:6-SEQIDNO:10-SEQIDNO:7顺序串联起来，构建成一个大小为327bp的基因，该基因即为疫苗靶点OVepis基因，其核苷酸序列以及对应的氨基酸序列如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示；其中，核苷酸序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2编码的拟态弧菌黏附素蛋白OmpU对应的2个B细胞线性表位的氨基酸序列如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示；核苷酸序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5编码的拟态弧菌溶血素蛋白VMH对应的3个B细胞线性表位的氨基酸序列如SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所示；核苷酸序列SEQIDNO:6和SEQIDNO:7编码的拟态弧菌溶血素蛋白VMH对应的2个模拟表位的氨基酸序列如SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示。优选的，所述S2具体包括如下步骤，S21、通过基因工程方法构建携带免疫载体草鱼CD74蛋白编码基因和拟态弧菌疫苗靶点OVepis基因的嵌合基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-CD74(1-261bp)-Ovepis-CD74(280-711bp)；S22、制备大肠杆菌DH5α菌蜕冻干粉；S23、将S22中获得的菌蜕冻干粉用HBS缓冲液溶解后装载真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-CD74(1-261bp)-Ovepis-CD74(280-711bp)，且上述菌蜕冻干粉与重组质粒的质量比为5:2，获得拟态弧菌靶向表位基因疫苗；S24、将S23中获得的疫苗放于-20℃冻存或冻干成粉剂室温保存、备用。优选的，所述S21具体包括如下步骤：S211、根据GenBank中收录的草鱼CD74的mRNA序列，设计一对特异性引物，其中，上游引物为5'-CTAGCTACGATGGACGAGCATC-3'，如SEQIDNO:21所示，下划线部分为NheI酶切位点，下游引物为5'-CCGCTCGAGTTACTCTGAGCCACACTGGG-3'，如SEQIDNO:22所示，下划线部分为XhoI酶切位点，以草鱼头肾cDNA为模板，PCR扩增CD74蛋白编码基因，长度为711bp，回收PCR产物；用NheI/XhoI双酶切PCR产物和真核表达质粒pcDNA3.1(+)，再用T4DNA连接酶连接回收后的CD74蛋白编码基因和质粒pcDNA3.1(+)的消化片段，获得真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-CD74；S212、合成S21中所述嵌合基因的前806bp基因片段，方向从序列5’端到3’端，并在其5’端添加NheI酶切位点，克隆至pUC57质粒中，获得重组克隆质粒pUC57-CD74(1-261bp)-Ovepis-CD74(280-497bp)；S213、用NheI/SacI双酶切重组克隆质粒pUC57-CD74(1-261bp)-Ovepis-CD74(280-497bp)，回收其中CD74(1-261bp)-Ovepis-CD74(280-496bp)消化片段；同时，用NheI/SacI双酶切pcDNA3.1(+)-CD74，回收其中pcDNA3.1(+)-CD74(497-711bp)消化片段，再用T4DNA连接酶连接上述2个消化片段，获得嵌合基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-CD74(1-261bp)-Ovepis-CD74(280-711bp)。优选的，所述S22具体包括如下步骤：将自行构建的含有温控裂解质粒pBV220-LysisE的重组大肠杆菌E.coliDH5α接种含终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的LB培养液，28℃、180rpm振荡培养过夜；按体积比为1:100比例将经培养过夜后的菌液转接至含终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的LB培养液，28℃振荡培养至OD600nm至0.4时，转至42℃诱导培养2.5h后，8000rpm离心10min，收集沉淀并用无菌磷酸盐缓冲液离心洗涤2次，获得新鲜的大肠杆菌DH5α菌蜕，将新鲜菌蜕转移至安培瓶，经不加保护剂的真空冷冻干燥处理后，获得无活菌残留的大肠杆菌DH5α菌蜕冻干粉。优选的，所述S23具体包括如下步骤：用HBS缓冲液重悬大肠杆菌DH5α菌蜕冻干粉，每升上述HBS缓冲液包含氯化钠100mmol、乙酸钠10mmol和HEPES10mmol，保持上述HBS缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，S1、构建疫苗靶点OVepis基因；S2、将S1中设计的疫苗靶点OVepis基因插入免疫载体草鱼CD74蛋白编码基因中II类分子相关肽段区的第261～280bp之间，方向从序列5’端到3’端，形成一个大小为1020bp的CD74(1‑261bp)‑Ovepis‑CD74(280‑711bp)嵌合基因，再用靶向递送载体大肠杆菌DH5α冻干菌蜕装载上述嵌合基因，即获得所述靶向表位基因疫苗；所述嵌合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

【技术特征摘要】
1.一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，S1、构建疫苗靶点OVepis基因；S2、将S1中设计的疫苗靶点OVepis基因插入免疫载体草鱼CD74蛋白编码基因中II类分子相关肽段区的第261～280bp之间，方向从序列5’端到3’端，形成一个大小为1020bp的CD74(1-261bp)-Ovepis-CD74(280-711bp)嵌合基因，再用靶向递送载体大肠杆菌DH5α冻干菌蜕装载上述嵌合基因，即获得所述靶向表位基因疫苗；所述嵌合基因的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。2.根据权利要求1所述的一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗的制备方法，其特征在于，所述S1中，构建疫苗靶点OVepis基因的具体方法如下：使用具有接头肽“丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸”的核苷酸序列SEQIDNO:8、具有接头肽“甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸”的核苷酸序列SEQIDNO:9以及具有接头肽“甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸”的核苷酸序列SEQIDNO:10，将拟态弧菌黏附素蛋白OmpU的2个B细胞线性表位的核苷酸序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，拟态弧菌溶血素蛋白VMH的3个B细胞线性表位的核苷酸序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和拟态弧菌溶血素蛋白VMH的2个模拟表位的核苷酸序列SEQIDNO:6、SEQIDNO:7按照SEQIDNO:1-SEQIDNO:8-SEQIDNO:2-SEQIDNO:8-SEQIDNO:3-SEQIDNO:8-SEQIDNO:4-SEQIDNO:8-SEQIDNO:5-SEQIDNO:9-SEQIDNO:6-SEQIDNO:10-SEQIDNO:7顺序串联起来，构建成一个大小为327bp的基因，该基因即为疫苗靶点OVepis基因，其核苷酸序列以及对应的氨基酸序列如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示；其中，核苷酸序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2编码的拟态弧菌黏附素蛋白OmpU对应的2个B细胞线性表位的氨基酸序列如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示；核苷酸序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5编码的拟态弧菌溶血素蛋白VMH对应的3个B细胞线性表位的氨基酸序列如SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所示；核苷酸序列SEQIDNO:6和SEQIDNO:7编码的拟态弧菌溶血素蛋白VMH对应的2个模拟表位的氨基酸序列如SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示。3.根据权利要求1所述的一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗的制备方法，，其特征在于，所述S2具体包括如下步骤，S21、通过基因工程方法构建携带免疫载体草鱼CD74蛋白编码基因和拟态弧菌疫苗靶点OVepis基因的嵌合基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-CD74(1-261bp)-Ovepis-CD74(280-711bp)；S22、制备大肠杆菌DH5α菌蜕冻干粉；S23、将S22中获得的菌蜕冻干粉用HBS缓冲液溶解后装载真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-CD74(1-261bp)-Ovepis-CD74(280-711bp)，且上述菌蜕冻干粉与重组质粒的质量比为5:2，获得拟态弧菌靶向表位基因疫苗；S24、将S23中获得的疫苗放于-20℃冻存或冻干成粉剂室温保存、备用。4.根据权利要求3所述的一种拟态弧菌口服靶向表位基因疫苗的制备方法，其特征在于，所述S21具体包括如下步骤：S211、根...

【专利技术属性】
技术研发人员：李槿年，曹际，刘心媛，刘雪兰，李琳，刘艳，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34