本发明专利技术公开了外膜蛋白VP1243在防治弧菌感染中的应用。外膜蛋白VP1243不仅具有良好的免疫原性，抗血清在稀释5000倍以上仍出现阳性反应；而且具有优异的免疫保护性，感染病原弧菌后免疫小鼠全部存活；经该外膜蛋白免疫后的动物机体不仅能够产生抗体，而且能够保护动物机体不再被相应的病原细菌感染致病；以外膜蛋白VP1243为靶位研制的亚单位疫苗、细菌活疫苗等，对预防和对抗由弧菌感染引起的弧菌病、弧菌肠炎具有重大意义，能够有效减少水产养殖业的损失，保证食品安全和人类健康。
Application of outer membrane protein VP1243 in the prevention and treatment of Vibrio infection
The invention discloses the application of outer membrane protein VP1243 in the prevention and treatment of Vibrio infection. The outer membrane protein VP1243 not only has a good immunogenicity, but the antiserum is still positive in more than 5000 times the dilution, and has excellent immune protection. The infected mice are immune to the pathogenic Vibrio, and the animal body can not only produce antibodies but also protect the animal body. Then it is infected by the pathogenic bacteria; the subunit vaccine and the live vaccine, which are targeted by the outer membrane protein VP1243, are of great significance to prevent and combat Vibrio and Vibrio enteritis caused by Vibrio infection. It can effectively reduce the loss of aquaculture and ensure food safety and human health.
【技术实现步骤摘要】
外膜蛋白VP1243在防治弧菌感染中的应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及外膜蛋白VP1243在防治弧菌感染中的应用。
技术介绍
弧菌为革兰氏阴性杆菌或弯曲杆菌，广泛分布于海洋、河口等各种盐度的水生环境，也可见于人或鱼肠道中。弧菌是最主要的海水养殖动物的病原菌，由病原弧菌引起的感染性疾病在世界各地普遍流行。我国沿海各省海水养殖业发达，但主要养殖品种如大黄鱼、鲈鱼、石斑鱼、牙鲆、大菱鲆、欧洲鳗等均受到弧菌病的严重危害。同时，副溶血弧菌也是也是引起世界范围内肠胃炎的主要病原菌之一，对该菌的研究已引起全世界的关注。目前，对由病原弧菌引起的感染性疾病的主要控制途径是使用抗生素，但由于长期用药可能引起水产品药物残留和耐药菌的传播问题，目前农业部对抗生素在水产养殖中的使用已有严格的规定，能够应用的种类少之又少。近年来，免疫预防由于其对动物无副作用、对环境的友好特性、预防特定疾病的有效性而备受重视，疫苗在水产动物病害控制中的应用正逐步推广。外膜蛋白(outermembraneproteins,OMPs)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，约占外膜结构的50％。外膜蛋白直接与外环境接触，在维持外膜结构、物质运输、细胞表面识别和信号转导等方面起重要作用，而且某些外膜蛋白可促进细菌粘附和定植、干扰或逃避宿主的免疫防御作用，是病原菌感染以及致病的关键因素之一。近年来的研究已证实某些外膜蛋白具有良好的免疫保护性，可促进宿主产生免疫防御反应，是极具发展前景的疫苗靶位。利用具有免疫保护性的外膜蛋白研制的亚单位疫苗，有着广阔的发展前景。因此，筛选鉴定对病原弧菌具有防治作用的外膜蛋白是控制由病原弧菌引起的感染性疾病的良好途径。
技术实现思路
本申请提供了外膜蛋白VP1243在防治弧菌感染中的应用，该外膜蛋白VP1243不仅具有良好的免疫原性，而且具有优异的免疫保护性，经该外膜蛋白免疫后的动物机体不仅能够产生抗体，而且能够保护动物机体不再被相应的病原细菌感染致病。本专利技术中，外膜蛋白VP1243是指具有如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的蛋白。弧菌感染会导致感染个体或群体罹患弧菌病或弧菌肠炎等疾病，本专利技术中，所述的弧菌病是指由能够表达所述外膜蛋白VP1243的病原弧菌引起的鱼类、虾类、贝类等海水养殖动物病变。所述弧菌肠炎主要是指由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的动物机体病变。所述的动物机体包括海水养殖动物，也包括人类等哺乳动物；人类等哺乳动物感染弧菌肠炎主要表现为食用烹饪不当的海产品或盐腌制品后出现的食物中毒。一般情况下，只要某病原弧菌能够表达所述外膜蛋白VP1243，那么所述外膜蛋白VP1243即能用于防治该病原弧菌。在目前看来，能够表达所述外膜蛋白VP1243的病原弧菌主要是副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)。本专利技术还提供了一种用于防治弧菌感染的亚单位疫苗，该亚单位疫苗由具有如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的外膜蛋白VP1243佐以药学上可接受的佐剂而成。本专利技术还提供了一种用于防治弧菌感染的细菌活疫苗，该细菌活疫苗由能表达具有如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的外膜蛋白VP1243的细菌制成。本专利技术还提供了包含编码具有如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的外膜蛋白VP1243的基因的表达载体或重组转化子。本专利技术还提供了所述的表达载体或重组转化子在制备用于防治弧菌感染的亚单位疫苗中的应用，以及所述的表达载体或重组转化子在制备用于防治弧菌感染的细菌活疫苗中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：外膜蛋白VP1243不仅具有良好的免疫原性，抗血清在稀释5000倍以上仍出现阳性反应；而且具有优异的免疫保护性，感染病原弧菌后免疫小鼠全部存活；经该外膜蛋白免疫后的动物机体不仅能够产生抗体，而且能够保护动物机体不再被相应的病原细菌感染致病；以外膜蛋白VP1243为靶位研制的亚单位疫苗、细菌活疫苗等，对预防和对抗由弧菌感染引起的弧菌病、弧菌肠炎具有重大意义，能够有效减少水产养殖业的损失，保证食品安全和人类健康。附图说明图1为PCR扩增副溶血弧菌VP1243基因的电泳检测结果图；图2为质粒pET32a(+)的双酶切鉴定结果图；图3为重组质粒pET32a(+)-VP1243的双酶切鉴定结果图；图4为重组大肠杆菌诱导表达VP1243蛋白的电泳检测结果图；其中，M.Marker；1.未诱导；2.IPTG诱导；3.超声后的上清；4.超声后的沉淀；图5为VP1243蛋白纯化过程中尿素洗涤后的电泳检测结果图；其中，M.Marker；1.8M尿素溶解后上清；2.8M尿素溶解后沉淀；图6为VP1243蛋白纯化过程中镍柱亲和层析后的电泳检测结果图；其中，M.Marker；1.样品过柱后；2.用含10mM咪唑的Ni柱结合缓冲液洗脱；3.用含50mM咪唑的Ni柱结合缓冲液洗脱；4.用含100mM咪唑的Ni柱结合缓冲液洗脱；5.用含200mM咪唑的Ni柱结合缓冲液洗脱；6.用含250mM咪唑的Ni柱结合缓冲液洗脱；7.用含500mM咪唑的Ni柱结合缓冲液洗脱；图7为VP1243蛋白纯化后浓缩样品的电泳检测结果图；其中，M:Marker；1:浓缩后的蛋白样品；图8为采用Dot-blot法鉴定VP1243免疫小鼠后抗血清效价的结果图；图9为注射感染副溶血弧菌后免疫小鼠和正常小鼠的存活情况图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细说明。实施例11.VP1243基因的引物设计根据NCBI数据库中VP1243基因的碱基序列，以pET-32a(+)作为载体，设计引物序列(在引物的两端分别加BamHI和XhoI两种酶的酶切位点)，引物信息见表1。表1.PCR引物2.副溶血弧菌的基因组DNA的提取(1)挑取副溶血弧菌POR1的单菌落放在5mLLBS培养基中培养，37℃摇庄中过夜；(2)在前一晚的菌液中取2mL分别放在两个1.5mLEP管中，再12000rpm的转速，离心样品约1min，倒掉上清，收集沉淀；在之前的每个EP管中加入1mL无菌水，让沉淀开始悬浮，然后在10000rpm的转速下离心两次，每次离心时间为2min；(3)向离心后的管中加入200μL无菌水，吹悬沉淀，将EP管放置于沸水浴中10min，然后把管放在冰中约10min；(4)在10000rpm转速的条件下，用离心机离心10min，用EP管装入新的取出来的上清，让其在超微量紫外可见分光光度计来检测，以便知道它的浓度和纯度，备用。3.VP1243基因的扩增把副溶血弧菌的POR1基因组作为目的基因的扩增模板，扩增VP1243基因，PCR反应体系如表2。表2.PCR反应体系PCR扩增程序：在94℃预变性5min接着95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min，一共30个循环；最后68℃延伸10min；扩增完成后通过1％的琼脂糖凝胶电泳作为鉴定，结果正确的则将目的基因的扩增片段回收。鉴定结果如图1所示。扩增产物在500bp与750bp间有一条明显的条带，与理论上VP1243基因序列长度546bp一致。4.pET-32a(+)质粒的提取(1)把之前平板上的菌落挑取一个加入到含有5mLLB液体培养基中，在培养基中加入Amp(按本文档来自技高网...
【技术保护点】
外膜蛋白VP1243在防治弧菌感染中的应用。
【技术特征摘要】
1.外膜蛋白VP1243在防治弧菌感染中的应用。2.如权利要求1所述外膜蛋白VP1243在防治弧菌感染中的应用，其特征在于，所述外膜蛋白VP1243的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。3.如权利要求1所述外膜蛋白VP1243在防治弧菌感染中的应用，其特征在于，所述弧菌感染由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起。4.用于防治弧菌感染的亚单位疫苗，其特征在于，由具有如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的外膜蛋白VP1243佐以药学上可接受的佐剂而成。5.如权利要求4所述用于防治弧菌感染的亚单位疫苗，其特征在于，所述弧菌感染由副溶血弧菌(Vibriop...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘建义，查振中，李守梁，李伟燕，蔡兴浩，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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