本发明专利技术提供一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，涉及重组质粒标准品量化定标方法领域。一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，包括如下步骤：配制含有ddPCR™Supermix for Probes、引物、探针和模板的反应体系；采用微滴发生器将反应体系进行微滴化处理；将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行PCR扩增反应；使用微滴读取仪读取结果数据，计算重组质粒标准品浓度。本发明专利技术定量检测方法准确性高、灵敏度高、重复性好、适用性广的、基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法。
【技术实现步骤摘要】
一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法
本专利技术涉及重组质粒标准品量化定标方法领域，具体涉及一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法。
技术介绍
空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种重要的食源性致病菌，是导致人类细菌性腹泻的主要原因之一。近年来对空肠弯曲菌的研究逐渐增多，建立了多种基因检测方法。其中实时荧光定量PCR方法的应用最广，被国内外多个权威检测机构所认可。在基因检测方法的研究中，标准品是关键因素之一。目前标准品使用较多的是细菌的稀释液和目的片段的重组质粒。细菌稀释液一般采用平板培养法计数，但培养过程往往受多种因素影响，因此平板计数所得到的细菌数量与实际值偏差较大。目的片段重组质粒一般采用分光光度法测得核酸质量，然后通过质量摩尔数公式来进行理论推算，因此计算的数值与实际有效扩增片段的数量差异较大。如果应用上述两种方法得出的标准物质来建立空肠弯曲菌的基因检测方法，则在方法研究所得到的灵敏度、重复性方面会存在不可避免的偏差。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种准确性高、灵敏度高、重复性好、适用性广的、基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，包括如下步骤：(1)配制含有ddPCRTMSupermixforProbes、引物、探针和模板的反应体系；(2)采用微滴发生器将反应体系进行微滴化处理；(3)将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行PCR扩增反应；(4)使用微滴读取仪读取结果数据，计算重组质粒标准品浓度。优选的技术方案中，所述反应体系含有ddPCRTMSupermixforProbes10μL、上下游引物各0.5μL、探针0.25μL、去离子水3.75μL、模板5μL。优选的技术方案中，PCR扩增反应条件如下：95℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火40s，共40个循环；98℃保持10min。优选的技术方案中，PCR扩增反应中，升温速度为1-5℃/秒，降温速度为1-5℃/秒。优选的技术方案中，微滴发生器和微滴读取仪来自Bio-Rad公司QX200TMDropletDigitalTMPCR系统。优选的技术方案中，所述重组载体是将空肠弯曲菌完整的或部分hipO基因插入pCzn1载体后得到的；或者所述重组载体是将空肠弯曲菌完整的或部分hipO基因插入pCzn1载体、经酶切线性化后得到的。优选的技术方案中，所述引物包括C5-F和C5-R，所述C5-F的序列如SEQIDNO:2所示，所述C5-R的序列如SEQIDNO:3所示；所述探针的序列如SEQIDNO:4所示，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。优选的技术方案中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。本专利技术提供的定量检测方法，具有准确性高、灵敏度高、重复性好、适用性广的特点，表现在：(1)灵敏度高：ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品的灵敏度可达到3.2copy/μL。(2)重复性好：使用ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品，其三个连续稀释度的检测结果具有较好的10倍比例关系，且复孔之间的检测结果值的相对标准偏差(RSD)较小。因此，使用ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品的重复性较好。(3)适用性广：利用ddPCR方法分别检测较大目的片段的重组质粒、较小目的片段的重组质粒和经XbaI酶切后的大片段重组质粒标准品，灵敏度、重复性都很好。因此ddPCR方法可用来检测多种类型的重组质粒标准品，适用性广。附图说明图1是ddPCR方法检测重组质粒A标准品的结果图，横坐标代表微滴数，单位：个，纵坐标代表荧光强度。图2是ddPCR方法检测重组质粒C的结果图，横坐标代表微滴数，单位：个，纵坐标代表荧光强度。图3是ddPCR方法检测重组质粒B的结果图，横坐标代表微滴数，单位：个，纵坐标代表荧光强度。具体实施方式本专利技术中使用Bio-Rad公司QX200TMDropletDigitalTMPCR系统，该系统包括微滴发生器、封膜仪、微滴读取仪及QuantaSoft分析软件。实施例1构建空肠弯曲菌重组质粒标准品重组质粒A：扩增空肠弯曲菌的HipO基因(1152bp，序列如SEQIDNO：1所示)，将该片段亚克隆到载体pCzn1(购自钟鼎生物)的NdeI和XbaI位点之间，获得含有目的基因的重组质粒pCzn1-HipO，记为重组质粒A。重组质粒B：将重组质粒A采用XbaI在37℃消化2h，进行酶切线性化。酶切体系见表1。表1质粒酶切体系其中，10×Mbuffer和XbaI购自Takara。BSA是牛血清白蛋白。重组质粒C：扩增目的片段：HipO基因第524～633位核苷酸片段。将该目的片段亚克隆到载体pCzn1的NdeI和XbaI位点之间，获得重组质粒C。实施例2使用ddPCR方法定量检测重组质粒标准品的灵敏度利用微滴式数字PCR(ddPCR)方法定量检测重组质粒B标准品(实施例1方法获得)，将该标准品做10倍系列稀释。1.选择4个连续稀释度(分别为10-3、10-4、10-5、10-6)，每个稀释度做3个复孔；2.配制ddPCR反应体系：ddPCR反应体系包括：ddPCRTMSupermixforProbes(Bio-Rad公司，产品编号1863010)10μL、上下游引物各0.5μL、探针0.25μL、去离子水3.75μL、模板(重组质粒B标准品)5μL，总体积20μL。其中上下游引物的浓度均为10μM，探针的浓度为10μM。上游引物为C5-F，C5-F的序列(SEQIDNO:2)如下:5’-CGGATAGTTATAGTATTGAAGTTATTGG-3’。下游引物为C5-R，C5-R的序列(SEQIDNO:3)如下:5’-GAAGCAGCATAAATAGGATCTTTTG-3’。探针的核苷酸序列(SEQIDNO:4)如下:5’-TTCTGGAGCACTTCCATGACCACC-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ。阴性对照(NTC)中以去离子水替代模板。3.生成微滴：将配制好的反应体系，放置微滴发生器中自动生成微滴。4.PCR扩增：将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行PCR扩增反应。PCR扩增反应条件如下：95℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火40s，共40个循环；98℃保持10min。PCR扩增反应中，升温速度为2℃/s，降温速度为2℃/s。5.结果读取与分析：使用微滴读取仪读取结果数据，QuantaSoft分析软件分析数据，计算得到不同稀释度重组质粒的浓度，结果见表2。表2ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品浓度结果注：表2中“KONG”表示代表空肠弯曲菌，“Nocall”表示无计数结果。根据实验结果可知，ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品的灵敏度可达到3.2copy/μL。实施例3使用ddPCR方法检测重组质粒标准品的重复性利用ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒C标准品(实施例1方法获得)，将标准品做10倍系列稀释。1.选择3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，包括如下步骤：（1）配制含有ddPCR™ Supermix for Probes、引物、探针和模板的反应体系；（2）采用微滴发生器将反应体系进行微滴化处理；（3）将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行PCR扩增反应；（4）使用微滴读取仪读取结果数据，计算重组质粒标准品浓度。
【技术特征摘要】
1.一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，包括如下步骤：（1）配制含有ddPCR™SupermixforProbes、引物、探针和模板的反应体系；（2）采用微滴发生器将反应体系进行微滴化处理；（3）将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行PCR扩增反应；（4）使用微滴读取仪读取结果数据，计算重组质粒标准品浓度。2.根据权利要求1所述基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，其特征在于所述反应体系含有ddPCR™SupermixforProbes10μL、上下游引物各0.5μL、探针0.25μL、去离子水3.75μL、模板5μL。3.根据权利要求1或2所述基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，其特征在于PCR扩增反应条件如下：95℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火40s，共40个循环；98℃保持10min。4.根据权利要求3所述基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，其特征在于PCR扩增反应中，升温速度为1-5℃/秒，...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵景东，祝长青，崔思宇，吴瑜凡，扶庆权，王毅谦，吴福平，郭旸，
申请(专利权)人：张家港出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，南京晓庄学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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