高产白藜芦醇突变体筛选方法的建立技术

本发明专利技术涉及白藜芦醇的生产领域。具体地，涉及用于白藜芦醇生产的4CL1酶突变体。具体地，例如，该突变体相对于氨基酸序列由SEQ ID NO：27所示的野生型4CL1而言，第169位氨基酸由Glu突变为Asp，第536位氨基酸由Phe突变为Tyr。

Establishment of a screening method for high yield resveratrol mutants

The present invention relates to the production field of resveratrol. In particular, 4CL1 enzyme mutants for resveratrol production are involved. Specifically, for example, the mutant has a 169th - bit amino acid mutation from Glu to Asp and a 536th - bit amino acid mutation from Phe to Tyr in relation to the amino acid sequence of the wild type 4CL1 shown by SEQ ID NO:27.

【技术实现步骤摘要】
高产白藜芦醇突变体筛选方法的建立
本专利技术涉及白藜芦醇的生产。具体地，涉及用于白藜芦醇生产的4CL1酶突变体，以及筛选该突变体的调控蛋白TtgR的突变体。
技术介绍
白藜芦醇最初是发现于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物。具有抗菌消炎、抗氧化、抗癌、预防心血管疾病等多种药用价值。目前市场上的白藜芦醇多通过从虎杖中通过化学提取得到。虽然目前已经实现在大肠杆菌及酵母中利用来源于植物的基因合成白藜芦醇。但现有的白藜芦醇检测手段仅限于高效液相色谱，缺乏可视化、高通量的检测筛选方法。无法方便、快捷地将白藜芦醇的产量在微生物细胞的合成中进行产量最大化的优化。
技术实现思路
本专利技术通过改造调控蛋白TtgR，使其能够响应白藜芦醇的浓度，从而通过调节lacZ基因的表达，利用蓝白斑的原理，快速高效地筛选出产生白藜芦醇菌株。该方法节省时间，简化了筛选步骤。一方面，本专利技术涉及调控蛋白基因ttgR的突变体，其特征在于编码序列如SEQIDNO：9所示，其编码的氨基酸序列相对于野生型调控蛋白TtgR而言，第38位氨基酸由丙氨酸突变为了苏氨酸，其中所述野生型调控蛋白TtgR由SEQIDNO：5编码。在另一方面，本专利技术涉及4CL1酶的突变体，其特征在于选自由以下各项组成的组：(1)相对于氨基酸序列由SEQIDNO：27所示的野生型4CL1而言，第169位氨基酸由Glu突变为Asp，第536位氨基酸由Phe突变为Tyr；(2)相对于氨基酸序列由SEQIDNO：27所示的野生型4CL1而言，第48位氨基酸由Ile突变为Ser或Thr，第112位氨基酸由Phe突变为Leu或Ile，Val，Ala，Gly或Trp；(3)相对于氨基酸序列由SEQIDNO：27所示的野生型4CL1而言，第250位氨基酸由Ile突变为Leu，Val，Ala或Gly，第404位氨基酸由Asn突变为切s，Arg，Tyr或Phe，第461位氨基酸由Ile突变为Val，Leu，Ala或Gly；(4)相对于氨基酸序列由SEQIDNO：27所示的野生型4CL1而言，第31位氨基酸由Asp突变为Thr或Ser，第510位氨基酸由Ser突变为Gln或Asn；(5)相对于氨基酸序列由SEQIDNO：27所示的野生型4CL1而言，第221位氨基酸由Met突变为Phe或Tyr；(6)相对于氮基酸序列由SEQIDNO：27所示的野生型4CL1而言，第48位氨基酸由Ile突变为Ser或Thr，第112位氨基酸由Phe突变为Leu，Val，Ala或Gly，第169氨基酸由Glu突变为Asp或Glu；第536位氨基酸由Phe突变为Tyr。在另一个方面，本专利技术还涉及质粒，其图谱如图1a或图1b所示。在另一个方面，本专利技术还涉及上述的调控蛋白基因ttgR的突变体，其在筛选用于提高白藜芦醇产量的4CL1酶突变体或筛选产生白藜芦醇菌株中的应用。在另一个方面，本专利技术还涉及一种生产白藜芦醇的方法，其特征在于上述获得的所述4CL1酶突变体。在具体的实施方案中，我们在大肠杆菌中利用来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的4CL1(4-coumarate：CoAligase)基因以及经过优化后的来自酿酒葡萄(Vitisvinifera)的STS(stilbenesynthase)基因，以对香豆酸为底物在大肠杆菌BW25113中合成白藜芦醇。再通过改造来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)DOT-TIE的调控蛋白TtgR以及其结合的DNA序列，使其能够当大肠杆菌胞内不生产白藜芦醇时，调控蛋白TtgR结合在相应的DNA序列上，阻遏下游报告基因rfp或者lacZ的表达，而一旦胞内生成了白藜芦醇，白藜芦醇结合到调控蛋白上，使其构象发生改变从结合的DNA上脱落下来，开启了下游报告基因rfp或者lacZ的表达，从而可以转换为肉眼可见的信号。TtgR调控蛋白为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)DOT-TIE中调控外排泵基因ttgABC及其自身表达的调控蛋白，其多形成二聚体结合在PttgR以及PttgABC启动子区域，该启动子区域有一部分反向互补。该调控蛋白已被证实可结合四环素、氯霉素等抗生素，以及根皮素、槲皮素等黄酮类化合物。我们首次对其结合的启动子区域PttgABC改造使其能够在大肠杆菌中正常启动下游基因的表达以及对调控蛋白进行改造使其能够灵敏的响应白藜芦醇，且有剂量依赖性。关于氨基酸，本领域的普通技术人员了解，根据氨基酸的性质和结构，对20种基本氨基酸进行了分类。其中甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸同属于含一氨基一羧基的中性氨基酸；丝氨酸和苏氨酸同属于羟基氨基酸；赖氨酸和精氨酸同属于碱性氨基酸。附图说明图1：质粒pTtg与pTtgR的图谱。图2：显示调控蛋白TtgR对报告基因rfp红色荧光蛋白表达的影响，其中图2a显示在没有调控蛋白的情况下，rfp在PttgABC2的调控下表达正常。图2b显示当调控蛋白TtgR连接到质粒上时，TtgR能正常结合到PttgABC2序列上，抑制了rfp的表达，从而菌落为白色。图3：显示外加不同浓度的白藜芦醇(Resveratrol)分别对于TtgR野生型和TtgRmu3情况下报告基因rfp荧光强度的诱导曲线。图4：白藜芦醇生产途径。图5：白藜芦醇生产途径中用到的质粒pGAP-STS-4CL图谱。图6：平板上筛选高产白藜芦醇突变体，如图指示最蓝的单克隆为高产白藜芦醇突变体，如箭头所示。图7：4CL1野生型与突变体白藜芦醇产量具体实施方式虽然本专利技术已对其具体实施方式进行描述，然而某些修改和等同物对于本领域技术人员是显而易见的，并且旨在包括在本专利技术的范围之内。通过以下实施例对本专利技术进行阐述，以下实施例不以任何方式限制本专利技术。实施例1.pTtg以及pTtgR质粒的构建。以DsRed载体(Clontech公司，产品编号632412)为模板，以5’-cacccgcggcagcagtatttacaaacaaccatgaatgtaagtataatccgtgtggaattgtgagcggataa-3’(forwardprimer，SEQIDNO：1)和5’-ctgccgcgggtgcctaatgagtgagctaac-3’(reverseprimer，SEQIDNO：2)为引物进行PCR扩增。PCR体系：引物各0.2μM，dNTPs0.2mM，模板10ng，10×PyrobestBuffer5μL，Pyrobest0.3μL，去离子水将体积补至50μL。PCR反应条件为：94℃30s，50℃30s，72℃1min，以上程序30个循环。得到的PCR产物用SacII进行酶切后，用T4DNA连接酶(购自NEB公司)4℃连接4h，连接产物转入大肠杆菌MC1061(全式金公司)，获得重组菌。提取重组菌的质粒得到pTtg，质粒图谱如图1a。按常规方法，提取恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)DOT-TIE(ATCC)基因组作为模板，以5’-gcacatatggtccgtcgaaccaaagaag-3’(forwardprimer，SEQIDNO：3)和5’-agagagctctcatttgcgcagagccgggc-3’(reverseprimer，S本文档来自技高网...

【技术保护点】
调控蛋白基因ttgR的突变体，其特征在于编码序列如SEQ ID NO：9所示，其编码的氨基酸序列相对于野生型调控蛋白TtgR而言，第38位氨基酸由丙氨酸突变为了苏氨酸，其中所述野生型调控蛋白TtgR由SEQID NO：5编码。

【技术特征摘要】
1.调控蛋白基因ttgR的突变体，其特征在于编码序列如SEQIDNO：9所示，其编码的氨基酸序列相对于野生型调控蛋白TtgR而言，第38位氨基酸由丙氨酸突变为了苏氨酸，其中所述野生型调控蛋白TtgR由SEQIDNO：5编码。2.4CL1酶的突变体，其特征在于选自由以下各项组成的组：(1)相对于氨基酸序列由SEQIDNO：27所示的野生型4CL1而言，第169位氨基酸由Glu突变为Asp，第536位氨基酸由Phe突变为Tyr；(2)相对于氨基酸序列由SEQIDNO：27所示的野生型4CL1而言，第48位氨基酸由Ile突变为Ser或Thr，第112位氨基酸由Phe突变为Leu或Ile，Val，Ala，Gly或Trp；(3)相对于氨基酸序列由SEQIDNO：27所示的野生型4CL1而言，第250位氨基酸由Ile突变为Leu，Val，Ala或Gly，第404位氨基酸由Asn突变为Lys，Arg，Tyr或Phe，第461位...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊丹丹，梁朝宁，唐双焱，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11