一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种对尿液进行预处理并结合亲和层析柱对乌司他丁进行纯化方法，该方法包括以下步骤：对尿液进行冷冻、真空及微波预处理得乌司他丁粗品，然后通过疏水柱层析、亲和层析和凝胶过滤层析对乌司他丁粗品进行纯化，最后洗涤、冻干得到总收率在90％以上，总效价6700iu/mg以上的乌司他丁，对尿液进行一定程度的预处理，结合使用层析柱纯化处理，操作简单，且优选的填料和流速等参数提高了生产效率，大大降低生产成本，适合进一步开发利用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法。技术背景乌司他丁，又名人尿胰蛋白酶抑制剂(HumanUrinaryTrypsinInhibitor)，是从人体尿液中分离纯化的一种胰蛋白酶抑制剂，1909年，Beurer和Reich第一次报道了人体尿液中存在这种胰蛋白酶抑制剂。他由是由143个氨基酸组成的一种糖蛋白，N端为丙氨酸，C端为亮氨酸，在第10位丝氨酸和45位天冬氨酸上有糖链。丝氨酸上的O-糖苷链包含多个硫酸软骨素单元(5个Ch4S和10个Ch0S)。乌司他丁的分子量经HPLC法测定为60～70KD，经SDSPAGE测定为40～50KD，等电点为2.6，是一种对热稳定的酸性蛋白。乌司他丁对多种水解酶具有有效的抑制作用，对细胞膜、溶酶体膜有明显的稳定作用。乌司他丁在人体内不仅仅是一种酶抑制剂，同时还是参与细胞表达分泌调控的重要生理活性物质，在炎症等疾病状态下，乌司他丁由粒细胞酶水解释放到血液中，参与炎症反应的调控，局限炎症反应，帮助组织的修复；在机体遭遇重大打击，发生全身炎症反应时，减轻过度释放的炎症介质对机体组织造成的损伤。乌司他丁在临床上用于急性胰腺炎、急性循环障碍的治疗，以及大中型手术期的器官保护和危重症中全身性炎症反应、多器官功能障碍综合症的预防等。关于乌司他丁的纯化技术，国内有过报道比如：中国专利CN103073638B公开了一种一种亲和层析纯化乌司他丁的方法，其中公开了一种亲和层析纯化乌司他丁的方法。具体的说，就是以健康成年男性新鲜尿液为原料，经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70％以上，总效价不低于5000iu/mg。经过亲和层析后含有部分镍离子，纯化程度低，从而使制备出来的乌司他丁无法满足现有技术要求，且金属离子亲和层析的成本非常高，并不适用于实际生产需求。中国专利CN100528898公开了一种高纯度乌司他丁及其制备方法和含有乌司他丁的药物组合物，其中的尿液经处理之后再经疏水柱吸附和亲和层析柱纯化，以及利用金属螯合柱和金属蛋白结合，通过磷酸盐缓冲液进行洗脱，使乌司他丁得以纯化，虽然得到一定纯度的乌司他丁，但是该方法在用于实际工业化生产时同样存在成本高的问题。中国专利CN105384812公开了一种树脂再生提高柱效纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁复溶性的药物组合物，其中涉及纯化乌司他丁的方法，具体为经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70％以上，总效价不低于5000iu/mg，柱效提升约50％。该方法得到纯品虽然效价相对较高，但是收率相对不高。中国专利CN105399819公开了一种一种亲和层析纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物，经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70％以上，总效价不低于5000iu/mg。该方法同样也存在收率不高的问题。综上可知，目前的乌司他纯化方法要么在用于实际工业化生产时成本很高，要么得率和纯度活性等不能满需求，因此提高乌司他丁提取的纯度、收率和活性，同时降低生产成本是十分必要的。
技术实现思路
鉴于现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种用层析法纯化乌司他丁的方法。所述方法包括：(1)用氮气做保护气对尿液进行真空及微波处理并进行高速离心浓缩对尿液进行预处理；(2)以亲和层析为基础，加入疏水柱层析和凝胶过滤层析来纯化乌司他丁粗品。最终得到的乌司他丁收率、比活优于现有技术，冻干乌司他丁成品的各项生化指标均优于中国药典规定。为解决上述技术问题，具体而言，本专利技术过程是这样的。首先对尿液进行预处理，将尿液在冷冻机中进行冷冻，以氮气为保护气进行真空处理；对真空处理后的尿液在40-60℃下采用微波处理，微波处理功率为200-350w，微波处理时间为每吨尿液5-10min，对微波处理后的尿液进行高速离心浓缩，收集浓缩后的离心液；然后进行吸附、洗脱、盐析、干燥处理得到乌司他丁粗品。上述每吨尿液微波处理5-10min的含义为：每增加一吨尿液处理时间增加5-10min。例如，如果微波处理1吨尿液所需要的时间为6min，则微波处理2吨尿液需要的时间为12min，微波处理3吨尿液需要的时间为18min，其次类推。然后用层析纯化方法对乌司他丁粗品进行纯化，选用的层析柱可以为亲和层析柱、离子交换柱、疏水柱、吸附柱、金属螯合柱和凝胶过滤层析柱中的一种或几种。优选地，上述纯化方法，选用的层析柱可以为亲和层析柱、疏水柱、离子交换柱、金属螯合住和凝胶过滤层析柱中的一种或几种。进一步优选地，上述纯化方法，选用的层析柱选自亲和层析柱、疏水柱和凝胶过滤层析柱。上述离子交换柱可以选自QSepharoseH.P、QSepharoseF.F、QSepharose4F.F、QSepharoseXL、QAESephadexA-25、STREAMLINEQXL、DEAESepharoseF.F、DEAESepharoseA-25、DEAESepharoseA-50或STREAMLINEDEAE。上述金属螯合柱的填料可以选自ChelatingSepharoseFastFlow、CoSepharoseFF、NiSepharoseFF和CuSepharoseFF中的一种。上述亲和层析柱的填料可以选自CM-SephadexA-25、CM-SephadexA-50、CM-SephadexC-25、CM-SephadexC-50、SP-Sepharose2B、HiTraprProteinAFF、SP-Sepharose4B、SP-Sepharose6B、SP-SepharoseCL-2B、SP-SepharoseCL-4B、SP-SepharoseCL-6B或HiTraprProteinAHF中的一种。优选地，上述亲和层析柱的填料选自CM-SephadexC-25、CM-SephadexC-50、SP-Sepharose2B、HiTraprProteinAFF、SP-Sepharose4B、SP-Sepharose6B、SP-SepharoseCL-2B、SP-SepharoseCL-4B、SP-SepharoseCL-6B或HiTraprProteinAHF中的一种。进一步优选地，上述亲和层析柱的填料选自HiTraprProteinAFF或HiTraprProteinAHF中的一种。更进一步优选地，上述亲和层析柱的填料为HiTraprProteinAFF。在一些具体的实施方案中，上述亲和层析柱的填料为ProteinASepharoseCL-4B或ProteinASepharose4FF中的一种。在一些优选的实施方案中，上述亲和柱的填料为ProteinASepharoseCL-4B。上述疏水柱的填料可以选自：ButylSepharose4FastFlow、OctylSepharose4FastFlow、PhenylSepharose6FastFlow、Butyl-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取适量pH为4‑6.5的澄清尿液，首先在氮气保护下对其进行的冷冻真空处理，在真空条件下进行微波处理，然后离心浓缩，收集浓缩尿液中加入适量壳聚糖，并用精密pH试纸调节尿液pH为4.5‑6.5；吸附完全后用氨水洗脱0.5‑3h,在经过2‑5kg硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；(2)对步骤(1)得到的乌司他丁粗品进行层析柱纯化；(3)将步骤(2)得到的层析洗脱液依次进行微滤、超滤；(4)将步骤(3)得到的超滤液离心，弃上清，将沉淀用无水乙醇洗涤，留取沉淀物；(5)将步骤(4)得到的沉淀物冻干，即得乌司他丁。

【技术特征摘要】
1.一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取适量pH为4-6.5的澄清尿液，首先在氮气保护下对其进行的冷冻真空处理，在真空条件下进行微波处理，然后离心浓缩，收集浓缩尿液中加入适量壳聚糖，并用精密pH试纸调节尿液pH为4.5-6.5；吸附完全后用氨水洗脱0.5-3h,在经过2-5kg硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；(2)对步骤(1)得到的乌司他丁粗品进行层析柱纯化；(3)将步骤(2)得到的层析洗脱液依次进行微滤、超滤；(4)将步骤(3)得到的超滤液离心，弃上清，将沉淀用无水乙醇洗涤，留取沉淀物；(5)将步骤(4)得到的沉淀物冻干，即得乌司他丁。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述的微波处理，处理温度为40-60℃；处理功率为200-350w；微波处理时间为每吨尿液5-10min。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的层析柱选自亲和层析柱、离子交换柱、疏水柱、吸附柱、金属螯合柱和凝胶过滤层析柱中的一种或几种；优选地，上述层析柱为亲和层析柱、疏水柱和凝胶过滤层析柱。4.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述离子交换柱可以选自QSepharoseH.P、QSepharoseF.F、QSepharose4F.F、QSepharoseXL、QAESephadexA-25、STREAMLINEQXL、DEAESepharoseF.F、DEAESepharoseA-25、DEAESepharoseA-50或STREAMLINEDEAE。5.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述金属螯合柱的填料可以选自ChelatingSepharoseFastFlow、CoSepharoseFF、NiSepharoseFF和CuSepharoseFF中的一种。6.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述亲和层析柱的填料可以选自CM-SephadexA-25、CM-SephadexA-50、CM-SephadexC-25、CM-SephadexC-50、SP-Sepharose2B、HiTraprProteinAFF、SP-Sepharose4B、SP-Sepharose6B、SP-SepharoseCL-2B、SP-SepharoseCL-4B、SP-SepharoseCL-6B或HiTraprProteinAHF中的一种；优选地，上述的亲和层析柱的填料可以选自HiTraprProteinAFF或/和ProteinASepharoseCL-4B。7.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述疏水柱的填料可以选自：ButylSepharose4FastFlow、OctylSepharose4FastFlow、PhenylSepharose6FastFlow、Butyl-sSepharose6FastFlow、ButylSepharose4B或OctylSepharoseCL-4B中的一种；优选地，上述疏水柱的填料为PhenylSepharose6FastFlow。8.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述凝胶过滤层析柱的填料可以选自Superdex30perpgrade、Superdex75perpgrade、Superdex200perpgrade、Superdex6perpgrade、Seph...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑少亮，王旭，肖益热，
申请(专利权)人：广东天普生化医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44