一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，属于鱼类疫病检测技术领域。本发明专利技术的方法包括如下步骤：S1、制备胶体金；S2、胶体金标记单克隆抗体；S3、无乳链球菌的包被；S4、罗非鱼无乳链球菌抗体的检测及结果判断。本方法具有检测快速、操作简便、灵敏度高、特异性较好等优点，能为生产上提供罗非鱼无乳链球菌病有效的诊断监测技术，以保证及时控制罗非鱼无乳链球菌病的危害。

【技术实现步骤摘要】
一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法
本专利技术涉及鱼类疫病检测
，具体涉及一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法。
技术介绍
无乳链球菌是一种人畜共患、危害多种动物的重要病菌，在中国目前其主要危害罗非鱼养殖业。据世界粮农组织(FAO)统计，2008年中国罗非鱼养殖量达706585吨，占世界总产量的50％，罗非鱼成为名符其实的“水禽”。据统计，1980年后淡水鱼、海水鱼类中的链球菌感染在多个国家相继有爆发的报道，鱼类链球菌在世界范围内开始广泛流行。迄今为止，该病的流行区域已经涵盖欧洲、非洲、澳大利亚、亚洲以及北非、南非6个大陆的15个国家的淡水鱼和海洋鱼类。自2008年以来，中国南方罗非鱼养殖地区开始大范围爆发无乳链球菌病，死亡率高达50％～70％，2009年广东省养殖产区7～11月4个月中无乳链球菌感染造成1万多吨罗非鱼死亡；2011年，广西养殖产区5～10月6个月中无乳链球菌感染造成7000多吨罗非鱼死亡，经济损失高达8000多万元。近几年广西、广东等地区由于罗非鱼无乳链球菌的危害已不得不大量减少罗非鱼的养殖量，这给中国罗非鱼产业造成了重创。无乳链球菌病危害严重、具有极强的传染性，目前我国针对罗非鱼链球菌病的防控并无商品化疫苗，只能依赖严格的生产管理和抗生素治疗，因此建立快速有效的疾病早期诊断方法并对疫情进行监测，及时预警、预报，仍然是当前要解决的关键技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术存在的上述问题，提供一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，本方法具有检测快速、操作简便、灵敏度高、特异性好等优点，能为生产上提供罗非鱼无乳链球菌病有效的诊断监测技术，以保证及时控制罗非鱼无乳链球菌病的危害。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，包括如下步骤：S1、制备胶体金：采用Frens法制备胶体金溶液；S2、胶体金标记单克隆抗体：取步骤S1制备好的胶体金溶液，加入K2CO3，一边搅拌一边加入，10-20min后加入罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体，搅拌10-20min，加入新配制的10％BSA，继续搅拌10-20min后进行离心，离心结束后取出离心管，小心吸弃上清液，补充加入含1％BSA的PB缓冲液，洗涤，再离心一次，弃去上清液后，加入重悬液，即可得到胶体金标记好的单克隆抗体液，即为金标液，将金标液置于2-5℃保存，备用；S3、无乳链球菌的包被无乳链球菌点样处理：将灭活的无乳链球菌点加在硝酸纤维素膜上作为检测点，再将羊抗鼠IgG也点加在硝酸纤维素膜上作为对照点，完成点样，室温干燥后，用PBST洗涤液洗涤2-3次，干燥后加入5％BSA至硝酸纤维素膜被渗透，封闭10-20min，然后用PBST洗涤液洗涤2-3次，凉干，得到硝酸纤维素样品膜，放2-5℃保存，备用；S4、罗非鱼无乳链球菌抗体的检测及结果判断A检测过程：检测时，使用步骤S3得到的硝酸纤维素样品膜进行检测，在硝酸纤维素样品膜加入待检罗非鱼血清，罗非鱼血清渗滤后，加入PBST洗涤液，PBST洗涤液渗滤过后，加入步骤S2制得的金标液，金标液渗滤完后再加入PBST洗涤液，检测完成；B结果判断：检测完成后同时观察硝酸纤维素样品膜的变化，在5min内，若硝酸纤维素样品膜上出现两个斑点，即对照斑点和检测斑点，则是阳性；若硝酸纤维素样品膜只出现对照斑点，则是阴性；若硝酸纤维素样品膜不出现对照斑点，则结果判为无效。作为优选，步骤S1中，所述制备胶体金溶液是在每100mL质量浓度为0.01％的胶体溶液，加入质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液1mL，制备的金颗粒大小为40nm。作为优选，步骤S2中，所述罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体是由抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体细胞株2C10分泌而得的抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体2C10；所述抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体细胞株2C10即为杂交瘤细胞株2C10，保藏号为CCTCCNO:C201644。作为优选，步骤S2中，所述离心的具体参数如下：转速为12000rpm，温度为4℃，离心时间为1h。作为优选，步骤S2中，所述重悬液的加入量按每1mL胶体金溶液加入100μL重悬液。作为优选，步骤S2中，各组分的加入量如下：胶体金溶液10mL，0.02M的K2CO390μL，罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体180μg，新配制的10％BSA1mL。作为优选，步骤S2中，弃去上清液后，补充加入含BSA的PB缓冲液是由1g的BSA和100mL的PB缓冲液组成。作为优选步骤S2中，所述重悬液为：在0.05MpH8.0的硼酸盐缓冲液中含如下质量百分含量的组分：10％的蔗糖，3％的BSA和0.02％的叠氮钠。作为优选，步骤S3中，所述灭活的无乳链球菌的菌液浓度为1.5×109-1.5×104CFU(菌落形成单位)，点加在硝酸纤维素膜上的菌液加样量为2μL。作为优选，步骤S4的A中，所述罗非鱼血清的加入量为2μL。作为优选，步骤S4中，在检测前，还包括检测板的组装：将步骤S3点样处理后的硝酸纤维素样品膜装在金标卡壳上，组装时，在圆孔板底装上吸水纸，然后装上硝酸纤维素样品膜，合上圆孔板即可得到免疫胶体金渗滤法检测板；然后再使用免疫胶体金渗滤法检测板进行检测。所述的BSA为牛血清白蛋白。有益效果：1、本专利技术是利用罗非鱼单克隆抗体和胶体金技术建立的罗非鱼无乳链球菌抗体的检测方法，本检测方法操作简单，不需要特殊仪器设备，不需要专业知识的检验人员，并可以现场检测，生产者在使用时不需要具备的专门知识，只需要简单的检测培训就能使用。本专利技术的检测方法能把实验室复杂漫长和专业的检测过程直接转化为简单的现场检测。2、本专利技术的检测方法的检测快速，检测时间最长只需要5min。由于罗非鱼无乳链球菌病在流行季节通常呈爆发态势，发病急，因此快速现场的诊断监测，可为疫病的早期控制争得宝贵的时间。本检测方法能为罗非鱼无乳链球菌的监控和防治提供强有力的技术支撑。附图说明图1为用实施例检测罗非鱼的阴性血清和阳性血清的检测结果；图2为用实施例检测罗非鱼临床血清的检测结果；图中的标号：C-对照点，T-检测点。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术作进一步说明。实施例一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，包括如下步骤：1.1罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体的准备参照本申请人已申请的专利“抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株及其筛选方法和应用”，申请号CN201611214376.8，获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2C10和4G6。方法简述如下：采用常规的方法制备抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，用灭活的无乳链球菌免疫罗非鱼，然后提取免疫过的罗非鱼免疫球蛋白IgM，先采用饱和硫酸铵沉淀，再用Protein-A层析柱进行纯化；纯化后的罗非鱼免疫球蛋白IgM免疫Balb/C小鼠，经3次免疫和效价测定，采取高效价的小鼠脾细胞进行融合。经过半固体培养法筛选，选出对罗非鱼免疫球蛋白IgM具有特异性的单克隆抗体杂交瘤细胞株2C10和4G6。选择单克隆抗体杂交瘤细胞株2C10，采用常规的小鼠腹水法制备抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体2C10。本专利技术的方法所用到的抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备胶体金：采用Frens法制备胶体金溶液；S2、胶体金标记单克隆抗体：取步骤S1制备好的胶体金溶液，加入K2CO3，一边搅拌一边加入，10‑20min后加入罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体，搅拌10‑20min，加入新配制的10％BSA，继续搅拌10‑20min后进行离心，离心结束后取出离心管，小心吸弃上清液，补充加入含BSA的PB缓冲液，洗涤，再离心一次，弃去上清液后，加入重悬液，即可得到胶体金标记好的单克隆抗体液，即为金标液，将金标液置于2‑5℃保存，备用；S3、无乳链球菌的包被无乳链球菌点样处理：将灭活的无乳链球菌点加在硝酸纤维素膜上作为检测点，再将羊抗鼠IgG也点加在硝酸纤维素膜上作为对照点，完成点样，室温干燥后，用PBST洗涤液洗涤2‑3次，干燥后加入5％BSA至硝酸纤维素膜被渗透，封闭10‑20min，然后用PBST洗涤液洗涤2‑3次，凉干，得到硝酸纤维素样品膜，放2‑5℃保存，备用；S4、罗非鱼无乳链球菌抗体的检测及结果判断A检测过程：检测时，使用步骤S3点样处理后的硝酸纤维素样品膜进行检测，在硝酸纤维素样品膜加入待检罗非鱼血清，罗非鱼血清渗滤后，加入PBST洗涤液，PBST洗涤液渗滤过后，加入步骤S2制得的金标液，金标液渗滤完后再加入PBST洗涤液，检测完成；B结果判断：检测完成后同时观察硝酸纤维素样品膜的变化，在5min内，若硝酸纤维素样品膜上出现两个斑点，即对照斑点和检测斑点，则是阳性；若硝酸纤维素样品膜只出现对照斑点，则是阴性；若硝酸纤维素样品膜不出现对照斑点，则结果判为无效。...

【技术特征摘要】
1.一种利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备胶体金：采用Frens法制备胶体金溶液；S2、胶体金标记单克隆抗体：取步骤S1制备好的胶体金溶液，加入K2CO3，一边搅拌一边加入，10-20min后加入罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体，搅拌10-20min，加入新配制的10％BSA，继续搅拌10-20min后进行离心，离心结束后取出离心管，小心吸弃上清液，补充加入含BSA的PB缓冲液，洗涤，再离心一次，弃去上清液后，加入重悬液，即可得到胶体金标记好的单克隆抗体液，即为金标液，将金标液置于2-5℃保存，备用；S3、无乳链球菌的包被无乳链球菌点样处理：将灭活的无乳链球菌点加在硝酸纤维素膜上作为检测点，再将羊抗鼠IgG也点加在硝酸纤维素膜上作为对照点，完成点样，室温干燥后，用PBST洗涤液洗涤2-3次，干燥后加入5％BSA至硝酸纤维素膜被渗透，封闭10-20min，然后用PBST洗涤液洗涤2-3次，凉干，得到硝酸纤维素样品膜，放2-5℃保存，备用；S4、罗非鱼无乳链球菌抗体的检测及结果判断A检测过程：检测时，使用步骤S3点样处理后的硝酸纤维素样品膜进行检测，在硝酸纤维素样品膜加入待检罗非鱼血清，罗非鱼血清渗滤后，加入PBST洗涤液，PBST洗涤液渗滤过后，加入步骤S2制得的金标液，金标液渗滤完后再加入PBST洗涤液，检测完成；B结果判断：检测完成后同时观察硝酸纤维素样品膜的变化，在5min内，若硝酸纤维素样品膜上出现两个斑点，即对照斑点和检测斑点，则是阳性；若硝酸纤维素样品膜只出现对照斑点，则是阴性；若硝酸纤维素样品膜不出现对照斑点，则结果判为无效。2.如权利要求1所述的利用免疫胶体金渗滤法检测罗非鱼无乳链球菌抗体的方法，其特征在于：步骤S1中，所述制备胶体金溶液是在每100mL质量浓度为0.01％的胶体溶液，加入质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液1mL，制备的金颗粒大小为4...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文德，陈汉忠，梁万文，
申请(专利权)人：广西大学，广西壮族自治区水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：广西,45