视蛋白多肽及其使用方法技术

本公开提供视蛋白，包括具有增强的活性和/或增强的向质膜的运输的变体视蛋白。所述视蛋白可用于也由本公开提供的治疗性和筛选应用。

【技术实现步骤摘要】
视蛋白多肽及其使用方法本申请是申请日为2012年12月12日、专利技术名称为“视蛋白多肽及其使用方法”的中国专利技术专利申请No.201280068775.1的分案申请。交叉引用本申请要求2011年12月16日提交的美国临时专利申请No.61/576,858的优先权，该临时专利申请整体以引用方式并入本文。
技术介绍
各种各样的精妙机制已逐步形成，使得生物体能够获取光以实现多种生存功能，包括产生能量以及识别合适的生存环境。主要种类的光敏蛋白由7-跨膜视网膜紫质组成，这种视网膜紫质存在于整个生物界并发挥各式各样的功能。许多原核生物采用这些蛋白来控制质子梯度并保持膜电位和离子稳态，并且许多运动性微生物已逐步形成基于视蛋白的光感受器以调节鞭毛拍击并因而指导对具有最佳的光合作用光强度的环境的趋光性。由于它们的结构简单(光敏和效应器结构域都在单个基因内编码)和快速的动力学，微生物视蛋白可被视作精确的且模块化的用于引入非光敏细胞以使得能够对特定细胞过程进行快速光学控制的光敏组分。在最近几年中，基于这些和其他光敏蛋白的细胞扰动工具的开发产生了一种称为光遗传学的技术，其涉及遗传控制和光学控制的整合，以实现精确限定的事件在活组织的指定细胞内的功能获得或功能丧失。本领域存在对例如用于控制神经活动的去极化和超极化光遗传学工具的需求。专利技术概要本公开提供视蛋白，包括具有增强的活性和/或增强的向质膜的运输的变体视蛋白。所述视蛋白可用于也由本公开提供的治疗性和筛选应用。附图简述图1A-F描绘超极化工具的性质。图2A-F描绘超极化工具的性能。图3A-F描绘对得自盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)的ChR的表征。对于图3B：DChR1(SEQIDNO:15)、CChR1(SEQIDNO:16)、CChR2(SEQIDNO:17)、VChR1(SEQIDNO:18)和VChR2(SEQIDNO:19)。图4描绘编码得自盐生杜氏藻(SEQIDNO:20)的ChR的核苷酸序列。图5描绘编码得自盐生杜氏藻的ChR的核苷酸序列，其为了在哺乳动物细胞中表达而进行了密码子优化(SEQIDNO:21)。图6描绘盐生杜氏藻ChR的氨基酸序列(SEQIDNO:22)。图7A-7E描绘示例性变体视蛋白的氨基酸序列：图7A(SEQIDNO:23)；图7B(SEQIDNO:24)；图7C(SEQIDNO:25)；图7D(SEQIDNO:26)和图7E(SEQIDNO:27)。图8A-8C描绘苏打嗜盐菌(Halorubrumsodomense)古细菌视紫红质-3的氨基酸序列及其编码核苷酸序列：图8A(SEQIDNO:28)；图8B(SEQIDNO:29)和图8C(SEQIDNO:30)。图9A和9B描绘苏打嗜盐菌菌株TP009视蛋白的氨基酸序列及其编码核苷酸序列：图9A(SEQIDNO:31)和图9B(SEQIDNO:32)。图10A-10C描绘斑点小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)视蛋白的氨基酸序列及其编码核苷酸序列：图10A(SEQIDNO:33)；图10B(SEQIDNO:34)和图10C(SEQIDNO:35)。定义本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指任何长度的氨基酸(可包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸)的聚合物形式，以及具有修饰肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列、具有或不具有N端甲硫氨酸残基的融合蛋白；免疫标记蛋白；等等。NH2是指出现在多肽的氨基端的自由氨基。COOH是指多肽的羧基端的自由羧基。与标准多肽命名法一致，使用了J.Biol.Chem.,243(1969),3552-59。本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸)的聚合物形式。因此，该术语包括但不限于单、双或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。核酸可以是双链、单链的或包含双链或单链序列的部分。本领域的技术人员将认识到，单链(“Watson”)的描述也限定了另一条链(“Crick”)的序列。在本文中所谓术语“重组核酸”是指非通常存在于自然界中的形式的一般通过用内切酶操纵核酸而最初在体外形成的核酸。因此，线性形式的分离核酸，或在通过连接通常未接合的DNA分子而在体外形成的表达载体，出于本专利技术的目的，两者都被视为重组的。应当理解，一旦制备了重组核酸并将其重新引入宿主细胞或生物体后，它就会非重组地复制，例如，在体内使用宿主细胞的细胞机器，而不是在体外操纵；然而，此类核酸一旦通过重组方式产生后，虽然随后进行非重组地复制，但出于本专利技术的目的仍被视为重组的。核酸序列同一性(以及氨基酸序列同一性)基于参比序列进行计算，参比序列可以是较大序列的子集，诸如保守基序、编码区、侧翼区，等等。参比序列通常将为至少约18个残基长，更通常至少约30个残基长，并且可以延伸到被比较的整个序列。用于序列分析的算法在本领域中是已知的，诸如在Altschul等人(1990),J.Mol.Biol.215:403-10(使用默认设置，即参数w＝4和T＝17)中所述的BLAST。术语“遗传修饰”是指向细胞中引入新的核酸(即，细胞的外源性核酸)后在细胞中引起的永久性或暂时性遗传改变。遗传改变(“修饰”)可通过将新的核酸并入宿主细胞的基因组或通过作为染色体外元件而暂时或稳定地维持新的核酸而实现。当细胞为真核细胞时，可通过将核酸引入细胞的基因组而实现永久的遗传改变。合适的遗传修饰方法包括病毒感染、转染、偶联、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等等。如本文所用的术语“分离的”意在描述多核苷酸、多肽或细胞，其所处的环境不同于该多核苷酸、多肽或细胞天然所处的环境。分离的遗传修饰宿主细胞可以存在于遗传修饰宿主细胞的混合群体中。分离的多肽在一些实施方案中将是合成的。“合成的多肽”由氨基酸装配而成，并使用本领域技术人员已知的程序在体外化学合成，例如无细胞化学合成。所谓“纯化”是指所关注的化合物(例如多肽)已与其在自然界中伴随的组分分开。“纯化”也可用于指代与其在制造期间(例如，在化学合成中)可伴随的组分分开的所关注的化合物。在一些实施方案中，化合物在以下情况中为基本上纯的：当按重量计至少50％至60％不含天然关联的或制造期间关联的有机分子时。在一些实施方案中，制备物含有按重量计至少75％、至少90％、至少95％或至少99％的所关注的化合物。例如，通过化学合成多肽，或通过纯化和化学修饰的组合可获得基本上纯的多肽。基本上纯的多肽也可以通过例如亲和层析而获得。纯度可通过任何适当的方法测量，例如色谱、质谱、高效液相色谱分析等等。本文可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于鼠科动物(大鼠、小鼠)、非人灵长类、人、犬科动物、猫科动物、有蹄动物(例如马科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、山羊)等等。在一些实施方案中，个体为人。在一些实施方案中，个体为鼠科动物。术语“治疗”、“处理”等在本文用于通常表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多肽，包含与图6所示的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2011.12.16 US 61/576,8581.一种分离的多肽，包含与图6所示的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。2.一种分离的多核苷酸，包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与图6所示的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。3.一种重组载体，包含根据权利要求2所述的多核苷酸。4.一种经遗传修饰的细胞，包含根据权利要求3所述的重组载体。5.一种分离的变体视蛋白多肽，以从氨基末端到羧基末端的顺序包含：a)与图8A所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)内质网(ER)输出信号。6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X为任何氨基酸；或FXYENE(SEQIDNO:4)，其中X为任何氨基酸。7.根据权利要求5所述的多肽，其中所述多肽还包含设置在(a)与(b)之间的荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·德赛罗斯，张锋，
申请(专利权)人：斯坦福大学托管董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US