克雷伯氏菌属的细菌分离物以及从其中分离的异麦芽酮糖合酶基因制造技术

本发明专利技术涉及一种新菌种的两个菌株，即新加坡克雷伯氏菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ）ＬＸ３及ＬＸ２１。本发明专利技术还涉及编码一种新型异麦芽酮糖合酶ＫＩＳ的核苷酸序列（ｋｉｓ）。还涉及在植物中产生异麦芽酮糖的方法，此方法包括在该植株细胞中引入一种编码将蔗糖转化成异麦芽酮糖的酶的核酸序列，从而使得转化细胞表达所述的核酸序列。本发明专利技术还涉及用于分离编码ＫＩＳ蛋白的核苷酸序列的功能克隆方法，包括步骤（ａ）从供体生物体制备基因库，其含有编码在适当的宿主生物体中的异麦芽酮糖生物合成活性的ＤＮＡ序列；（ｂ）利用它们的增加的还原糖含量从基因库中筛选目的克隆；（ｃ）分离含有编码具有异麦芽酮糖生物合成活性的蛋白的ＤＮＡ的克隆。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1.专利
本专利技术涉及细菌分子生物学和重组DNA技术。2.相关现有技术描述异麦芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖)是一种具有物理特性的还原糖，味似蔗糖。它是蜂蜜中天然存在的蔗糖的结构同分异构体(Sporns et al.，1992)。把异麦芽酮糖当作蔗糖的替代品有以下几点优势(1)它不被导致龋齿的口腔链球菌代谢，不腐蚀牙齿(Minami et al.，1990)；(2)它的摄入对血中糖和胰岛素的浓度影响很小，说明它可以做为肠道外营养物，非糖尿病和糖尿病患者都可以接受(Kawai，et al.，1989)；(3)与蔗糖不同，它在绝大多数细菌和酵母菌中不发酵，在酸性溶液中更稳定，异麦芽酮糖的这些特性便于保持它在发酵食物和饮料中的甜度和味道(Takazoe，1989；Schiweck etal.，1991)；(4)它不具有蔗糖和果糖的吸湿特性，含异麦芽酮糖的食物比含蔗糖的食物更稳定(Takazoe，1989)；(5)在人肠的微生物群区中，它选择性刺激双歧菌的生长(Mizutani，T.1989)。越来越多的证据表明双歧菌有助于保持人体的健康和减缓衰老的过程(Mitsuoka，T.1990)。在日本的食物中，异麦芽酮糖已广泛用做糖的替代品(Takazoe，1989)。利用生化方法把蔗糖转变成异麦芽酮糖，全世界每年的产量超过1万吨(Kunz，1993)。异麦芽酮糖还是合成表面活性剂和多聚物的原材料。因为每年的蔗糖产量达1亿1千万吨，所以它是世界上最高产的可再生产有机复合物。然而，因为它糖链间的不稳定性和缺乏特异化学反应性，所以利用蔗糖做为化学工业的原材料大大受限(Kunz，1993)。另一方面，异麦芽酮糖是蔗糖的还原性异构体，能被特异性氧化并衍生成不同的化学产品。异麦芽酮糖能成功制备聚酰胺和聚脲(Kunz，1993)。已知有几个菌种可以把蔗糖转变成异麦芽酮糖。美国专利No.4,359,531描述了生产异麦芽酮糖的过程，包括固定Erwinia rhapontici菌的整个菌体或整个或断裂菌体的溶剂抽提物。大约70-95％的蔗糖转变成异麦芽酮糖。美国专利No.4,390,627描述了从Protaminobacterrubrum固定蔗糖变位酶生产异麦芽酮糖的方法。美国专利No.4,670,387描述了使用Erwinia rhapontici、Protaminobacter rubrum、Serratia plymuthica、Esevinia carotovora var atroseptica、Erwiniadissolvens和Serratia merscescens的固定化菌体生产异麦芽酮糖的发酵过程。大约可以转化70-95％蔗糖。美国专利No.4,857,461公开了从Protaminobacter rubrum、Serratia plymuthica和Erwinia carotovora菌得到的固定化粗酶连续生产异麦芽酮糖的过程。美国专利No.5,229,276和No.5,336,617描述了用Pseudomonas mesoacidophila和Agrobacterium radiobacter菌的固定化菌体生产海藻糖和异麦芽酮糖的过程。单个酶——异麦芽酮糖合酶(EC5.4.99.10)可以把蔗糖转变成异麦芽酮糖。虽然几种细菌能够把蔗糖转变成异麦芽酮糖，但产量很不稳定，转化率为8-86％(Tsuyuki et al.，1992；Nagai et al.，1994；Huang etal.，1998)。而且，这些生产异麦芽酮糖的菌株不仅把蔗糖转化成异麦芽酮糖和海藻糖还产生2-7％的葡萄糖做为副产品(McAllister et al.，1990；Tsuyuki et al.，1992；Huang et al.，1998)。这是一个值得考虑的工业问题，因为需要复杂的纯化过程去除这些污染的复合物(Sugitani etal.，1993，U.S.Patent No.5,229,276)。一些菌株甚至能够把异麦芽酮糖水解成葡萄糖和果糖。最近，美国专利No.5,786,140公开了从几种有生物体中分离了蔗糖异构酶的基因。根据纯化的蔗糖异构酶N端的氨基酸序列，使用DNA探针从Protaminobacter rubrum和Enterobacter sp菌中克隆了蔗糖异构酶的基因。利用PCR技术进一步从E.Rhapontici和P.Mesoacidphila菌中分离了蔗糖异构酶的部分DNA序列。专利技术简述能够高效生产异麦芽酮糖的细菌和酶对于生物技术的应用和进一步理解酶的机制具有重大的意义。本专利技术涉及一个新细菌纯培养株，分类学鉴定为新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis)。该菌株具有高效的酶活把蔗糖转变成异麦芽酮糖。本专利技术进一步还包括使用此新加坡克雷伯氏菌的固定化菌体生产异麦芽酮糖的过程。与那些以前公开的专利相比，蔗糖的转化率超过99％，异麦芽酮糖的含量超过87％，葡萄糖的含量不到1％。利用功能性克隆方法从新加坡克雷伯氏菌克隆了编码蔗糖异构酶的新基因，与从Enterobacter sp菌分离得到的蔗糖异构酶高度同源，但有几个氨基酸的不同。附图简述附图说明图1是蔗糖培养基上生长的新加坡克雷伯氏菌菌株的负染电子显微镜照片。图2是从16S rRNA序列资料分析得到的系统进化树，显示了新加坡克雷伯氏菌菌株的位置。用邻域连接方法得到分枝模型。到下一个节点的数目显示了从1000个数据集得到的引导值百分率。图3详述了在所选的属于Enterobacteriaceae家族细菌中，根据部分rpoB基因序列资料分析得到新加坡克雷伯氏菌的系统发生位置。图4显示了在新加坡克雷伯氏菌培养物中异麦芽酮糖和KIS酶的活性。A是24小时细菌生长的详细情况。B是相同时间内KIS酶活性的详细情况。C是相同时间内培养基中检测到的异麦芽酮糖。图5是从新加坡克雷伯氏菌克隆KIS基因的策略。优选的克隆在LB肉汤培养基中，含5％蔗糖，37℃，200转/分钟培养18小时。用DNS方法(Miller，1959)判定肉汤中的还原糖。pBluescript II SK(+)做为插入片段的克隆载体。图6A是新加坡克雷伯氏菌KIS基因的核苷酸序列。上游和终止子区的DNA序列用斜体字，开放读码框(ORF)的DNA序列使用正常字体。推测的潜在核糖体结合区(SD)用下横线标示。上游推测的蔗糖可诱导区用双横线标出。螺旋-环-螺旋结合位点的同源序列用框标示。粗体字体表示下游终止位点。图6B是翻译后KIS蛋白的氨基酸序列。推测的蔗糖结合位点用下横线标示。图7是KIS基因中推测蔗糖可诱导启动子的富AT区相关的同源序列。Kis是新加坡克雷伯氏菌LX3中异麦芽糖合酶的基因。数字表示从转录起始点的距离(bp)，而kis中的数字表示从翻译起始点ATG的距离(bp)。图8详细比较了kis蛋白与利用蔗糖做底物的其他酶之间推测的蔗糖结合位点间的氨基酸序列。数字表示距离酶N末端的位置。专利技术详述从新加坡的土壤样品和甘蔗的根部分离了两株纯菌种LX3和LX21，它们能把蔗糖转化成异麦芽酮糖。根据以前发表的对克雷伯氏菌的描述(Orskov，1984)，此菌具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种命名为ＬＸ３的克雷伯氏菌菌属的菌株。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：张炼辉，李宪臻，张道海，
申请(专利权)人：分子农业生物学院，
类型：发明
国别省市：SG[新加坡]