生产抗冻蛋白的方法和生物体技术

本发明专利技术涉及制备一种新的抗冻肽的方法和由水性低温环境中的细菌，如Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓｐｒｏｔｅａ以及一种新的假单胞菌属物种获得的肽。这些抗冻肽可以适当地掺入冷冻食品产品如冷冻蔬菜和冷冻甜品如冰淇淋。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生产抗冻蛋白的方法。此外涉及用于此方法中的新生物体，由此获得的新蛋白，以及这种新蛋白的组合物和用途。一方面，它涉及新生物体Marinomonas protea的培养；由此获得的新抗冻蛋白；这种蛋白在控制冷冻方法中的用途，特别是在冷冻食品的生产中的用途；以及由此获得的食品。
技术介绍
所谓的‘抗冻蛋白’(AFPs)有修饰冰晶生长的特性。它们在作用上不同于更简单的离子抗冻剂如常见的盐。例如，水性的AFP溶液一般有一个低于其融点的冰点(滞后现象)。它们使冰晶在一定的温度范围稳定，以及抑制重结晶。它们似乎帮助生物体在水的冰点附近的温度中生存，因此发现于几种不同的生物体。它们的特性给予它们一个潜在的使用范围特别是在冷冻时食用的食品中，抑制重结晶和保持光滑的质地。在只是为了保存才冷冻的食品，AFPs可以抑制在冷冻，储存，转运，和解冻过程中重结晶，因此通过减少细胞破坏保存食品质地，也通过减少水滴来减低营养的丢失。(见Griffith，M.和Vanya Esart，K.Biotechnology Advances，13，pp375-402)。已知多种的AFPs来源最常见的是鱼和植物。一些细菌展现出抗冻特性(见Griffith等，supra，p382)。在一些情况下，已报道了细菌中抗冻蛋白的分离(例如XuH，Griffith M，Patten CL，et al.，Can J Microbiol44(1)64-73 Jan 1998)。考虑到抵抗冷冻的生物体的优势，抗冻蛋白没有更广泛地分布在自然界和更易被发现是令人吃惊地。这也许是因为生物体有其他的方式克服这种问题。反之，能帮助产生强壮，坚固的结构的鱼AFP有利于一些特殊的用途，RI活性但不产生坚固结构的AFP有其自己的，不同的优势。例如，可活跃地抑制储存时冰重结晶的分子可以用来保持在储存中冷冻产品光滑的质地。对一些冷冻食品，如乳品冰淇淋，这种分子的应用优选不使产品过度地变硬。因此对抗冻肽有一个要求，即在解冻和冷冻循环中有活性地抑制重结晶，以及能用来在储存过程中保持食品产品的光滑质地。合乎需要地，这些抗冻肽是热稳定的，由此它们能与经巴氏消毒或灭菌的食品产品相掺合，同时它们保持其功能。本专利技术(部分)建立的假设基础是，如果细菌定居在一种通常低于水的正常冰点的液体水性环境在这种环境中(假定)AFPs可以是一种有效方式给细菌一个竞争优势，它们是更可能使AFP蛋白进化。专利技术概述因此，在第一方面，本专利技术包括生产AFPs的方法，包括从水性低温环境收集一种或更多的细菌样品，培养细菌和从样品中提取蛋白，检测蛋白的抗冻特性，选择有较高的抗冻特性的蛋白，以及生产足量的作为AFP食品添加剂的筛选蛋白。专利技术进一步包括由此方法获得的新抗冻蛋白，它们在食品加工的用途，以及包含它们的食品组合物。专利技术详述将参照附图和序列标识来进一步描述本专利技术，其中序列编号1是一种来自Marinomonas protea的16S rRNA基因的DNA序列；序列编号2是一种来自假单胞菌属物种(作为“分离菌20”被分离)的16S rRNA基因的DNA序列。序列编号3是从Marinomonas protea分离的抗冻肽的N末端氨基酸序列。附图说明图1表示Marinomonas protea的16S rRNA序列(图3)与普通海单胞菌的对应序列的序列比对；图2是把Marinomonas protea与其最近的种系发生亲属进行比较的进化系统树。图3显示分离菌20的16S rRNA序列(序列编号2，大写)与Marinomonas protea 16S rRNA(序列编号1；小写)的比对，有89.4％相似性。图4显示分离菌20的16S rRNA序列(序列编号2)与它的最近的种系发生亲属类黄假单胞菌的比对，有99.4％相似性。图5是建立在比较分离菌20(序列编号2)和其最近亲属的16SrRNA序列基础上的进化系统树。通过使用空位罚分为10的Clustal方法建立了多种序列比对。图6显示在时间＝0(6A)和时间＝60分钟(6B)时RI实验的结果。图7，8，9涉及实施例中所描述的Vickers硬度试验。名词抗冻肽和抗冻蛋白在本专利技术的内容中可互换使用。这些名词缩写为AFP。对于一种水性的低温环境，我们表示一种环境，它主要包括一年中至少部分时间温度低于0℃的水。我们优选含盐环境，例如含有足够的盐成分(盐度)来显著降低冰的冰点(例如降低0.2℃或更多)。盐度可以多于或少于海水的盐度(35ppt)。能够收集细菌的优选的环境是盐湖(包括超盐湖)，或者在这种湖里的位点。特别地，我们优选从南极环境收集合适的细菌用于本专利技术。南极洲的盐湖通常是半对流湖或单对流湖。半对流湖有持久的化学和温度分层的水柱。在表面有更冷的少盐的水，深部有更温暖多盐的水。在南极洲这种湖在一年的大多时间被冰覆盖，只有在夏天短暂地破冰而出。在南极洲单对流湖是高盐湖，盐分太多以至于不能在冬天完全被冰覆盖。冰层像是热毯子。没有它，与空气接触的湖水冷到非常低的温度。在冬天它们的水柱以温度分层，冷水在表面，暖水在下面。在夏天分层打破，水柱有同一温度。就半对流和单对流两种南极湖来说，在冬天有时水温远远低于0℃。本专利技术进一步涉及从上述南极洲湖，优选从半对流湖或单对流湖分离的新细菌的培养物。我们进一步提供产生抗冻蛋白的海单胞菌属物种的纯细菌培养物，所述细菌培养物的16S rRNA基因序列与生物体Marinomonasprotea中的对应序列(序列编号1)表现出至少90％和优选95％的同源性。本专利技术进一步涉及产生抗冻蛋白的假单胞菌属物种的纯细菌培养物，所述细菌培养物的16S rRNA序列与序列编号2的基因序列表现出至少90％和优选至少95％的序列同源性。上述的培养在执行专利技术的方法过程中可获得。本专利技术的方法包括4个阶段一种或更多细菌样品的收集；培养细菌和蛋白提取；蛋白的检测和选择；以及蛋白的生产。1.样品收集在本专利技术的方法中使用的细菌样品从水性低温环境中收集。如前面所指出的，“低温”环境表示一年中至少部分时间中形成冰的环境。这种环境在高纬度和高经度或两者兼有时存在。我们优选收集来自盐环境，尤其是盐水湖的细菌。特别优选的环境在南极洲发现，可以包括半对流湖或单对流湖。这种湖包括有多种特性，例如温度和盐浓度的位点，细菌样品可以从许多这种位点收集，用于随后的实验室研究。2.蛋白提取每种细菌样品在适当条件下培养，由此生产抗冻蛋白，蛋白从液体培养基中通过标准方法提取，例如通过细胞离心，沉淀和在缓冲液中用玻璃球涡旋。3.蛋白检测步骤2中提取的蛋白通过检测其抗冻特性分类。有多种适当的检测方法。我们优选使用重结晶抑制试验如下面更详细的描述。它测量了蛋白存在时当储存在冷冻条件下时冰晶大小增加的倾向。通过使用此试验，可以筛选在其存在下重结晶和晶体生长停止或减少的有效AFP蛋白。有抗冻特性的蛋白定义为，在实施例所定义的重结晶分析中优选表现出在最大为1mg/ml的浓度下冰晶生长为6um或更少的蛋白。4.蛋白生产根据本专利技术的方法选择的蛋白大量被生产，用于AFP食品添加剂。这可以多种方式进行。例如，最初用来获得蛋白的方法(细菌培养后提取蛋白)可以按比例增加。通过对培养条件(温度，培养基，等)和细菌选择进行试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产抗冻肽的方法，包括从水性低温环境收集一种或更多的细菌样品，培养细菌并从样品中提取蛋白，检测蛋白的抗冻特性，选择有抗冻特性的蛋白，以及生产所选蛋白，其含量足够用作ＡＦＰ食品添加剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：MJ贝里，A格里菲斯斯，PJ希尔，J莱布尔尼帕里，SV米尔斯，
申请(专利权)人：荷兰联合利华有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]